使用五溴苯基柱对膳食补充剂中的α-/β-烟酰胺单核苷酸进行水相液相色谱-质谱（LC-MS/MS）定量分析

《Analytica Chimica Acta》：Aqueous LC-MS/MS quantification of α-/β-nicotinamide mononucleotide in dietary supplements using a pentabromophenyl column

基于全水相 reversed-phase 条件开发了首例可分离α-和β-烟酰胺单核苷酸异构体的 LC-MS/MS 方法，通过 PBr 色谱柱实现高立体选择性分离，并验证了方法在市售 NMN 补充剂分析中的有效性，发现产品成分与标签存在显著差异。

　　

钟思慧|吴念华|陈朝明|孙平伟|张汉伟|王信远|林宏宇

台湾台中433402，东松台中港湾医院家庭医学系

摘要

在本研究中，我们开发了一种LC-MS/MS方法，该方法能够在完全水性的反相条件下实现α-和β-烟酰胺单核苷酸（NMN）异构体的基线分离和定量。首先评估了三种常用的反相柱（Polar C18、F5和PBr），只有PBr相通过增强的π-π堆积、偶极-偶极相互作用和卤素键合提供了足够的立体选择性。使用0.1%的甲酸水溶液作为流动相，两种异构体在三分钟内即可实现基线分离。该方法经过线性、灵敏度、精度和基质效应的验证。当应用于八种商业NMN补充剂时，分析结果显示异构体组成存在显著差异，包括未声明或标签不准确的成分。总体而言，这项工作首次提出了在完全水性反相条件下实现NMN异构体特异性分析的LC-MS/MS方法，为产品认证、质量控制以及药代动力学和代谢组学研究提供了一个稳健且环境友好的平台。

引言

烟酰胺单核苷酸（NMN）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的关键生物合成中间体，NAD⁺是一种参与氧化还原反应[1]、能量代谢[2]和DNA修复[3]的中心辅酶。与年龄相关的NAD⁺水平下降与神经退行性疾病[4]、代谢功能障碍[5]和细胞再生能力下降[6]有关。自2013年首次报道NMN的抗衰老潜力以来，人们对其作为膳食补充剂中功能性成分的兴趣迅速增长[7][8]。由于NMN在牛奶[11]、水果和蔬菜[12]等食物中的天然含量较低，商业NMN补充剂主要通过化学[9]或酶促途径[10]合成。NMN存在两种立体异构体：α-NMN和β-NMN，它们仅在核糖部分的异头碳上有所不同（图1）。其中，β-NMN是生物活性形式，可作为NAD⁺回收途径中烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的直接底物[13]，而α-NMN不被NAD⁺生物合成酶识别，也没有明确的生理功能。其在补充剂中的存在可能引发关于生物利用度、功效和产品标签准确性的担忧。液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）结合已成为小分子定量的广泛采用的技术，因为它具有出色的选择性、灵敏度和与复杂生物和食品基质的兼容性[14]。在大多数情况下，质谱基于特定的前体/产物离子转换和保留时间匹配来实现化合物鉴定[15]。然而，像α-NMN和β-NMN这样的结构异构体具有相同的分子量和相似的碎片化模式，仅依靠质谱无法区分两者。因此，色谱分离对于确保异构体特异性分析至关重要[16]。尽管反相LC在常规分析中得到广泛应用，但传统的固定相如C18和五氟苯基（F5）通常无法分离α-NMN和β-NMN，因为它们的结构相似性很高且极性强。亲水相互作用液相色谱（HILIC）曾被探索作为替代方案，但其性能常因在高水条件下峰形扭曲和保留不良而受限，从而限制了其在常规质量控制中的应用[17]。为了解决这一分析挑战，我们开发了一种采用五溴苯基（PBr）柱的新型反相LC-MS/MS方法[18]。这种固定相提供了增强的π-π相互作用、偶极-偶极力和卤素键合，能够分离结构相似的极性化合物[19]。据我们所知，这是首次报道在完全水性反相条件下实现NMN异构体基线分离的方法。该方法不需要高浓度的有机溶剂或离子对试剂，因此更加环境友好，适合常规应用。所开发的方法经过验证，并应用于商业NMN补充剂，以评估异构体组成、标签准确性和产品一致性。

化学试剂

α-烟酰胺单核苷酸（α-NMN，纯度≥98%）购自加拿大多伦多研究化学品公司（Toronto, Canada）。β-烟酰胺单核苷酸（β-NMN，纯度≥98%）购自日本东京化学工业有限公司（Tokyo, Japan）。甲酸（FA）、甲酸铵（AmF）和醋酸铵（AmAc）购自德国达姆施塔特默克公司（Merck, Darmstadt, Germany）。去离子水使用Sartorius Arium Pro纯化系统（G?ttingen, Germany）制备。

RPLC柱

为了评估色谱分离效果

α-/β-NMN异构体的色谱分离

为了确定分离α-和β-NMN异构体的最佳色谱条件，系统评估了三种具有不同固定相的反相柱：Polar C18、F5和PBr。Polar C18柱是一种传统的烷基键合固定相，主要依赖于疏水相互作用，缺乏选择性的非共价机制，因此不适合异构体分离[20]。由于NMN具有高度亲水性，其在C18柱上的保留时间很短，导致只有一个宽峰。

结论

本研究建立了第一种能够在完全水性反相条件下使用PBr柱实现α-和β-烟酰胺单核苷酸异构体基线分离的LC-MS/MS方法。通过系统评估固定相和流动相添加剂，确定0.1%的甲酸水溶液为最佳洗脱液，从而实现了NMN异构体的稳健且可重复的立体特异性定量。与传统C18和F5相相比，PBr柱表现出更好的分离效果。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

作者贡献声明

林宏宇：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学。王信远：正式分析。孙平伟：监督。张汉伟：验证。吴念华：实验研究。陈朝明：软件开发。钟思慧：初稿撰写

数据可用性

数据可应要求提供。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用ChatGPT来优化语言和压缩文本。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

资金来源

本研究未接受来自公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。