单细胞转录图谱揭示Mustn1在肌肉骨骼组织血管周细胞中的保守定位

《JBMR Plus》：Single-cell transcriptional mapping of Mustn1 exhibits consistent mural cell localization across musculoskeletal tissues

本研究针对Mustn1基因在肌肉骨骼系统中的细胞定位不明确的问题，通过整合开源单细胞RNA测序数据集，系统绘制了Mustn1在多种组织中的表达图谱。研究发现Mustn1与Acta2(aSMA)在骨、滑膜、肌肉和肌腱的血管周细胞中显著共表达，并在Sox9谱系未表征细胞簇中与肌肉骨骼纤维脂肪组祖细胞(FAPs)和血管周细胞重叠。该研究为利用血管周细胞群体研究Mustn1在肌肉骨骼发育和修复中的作用提供了精准的细胞靶点。

　　

在探索肌肉骨骼系统发育与修复的分子机制时，研究人员一直面临一个关键挑战：如何精确识别特定基因在复杂组织中的细胞来源。传统批量RNA测序技术虽然能提供整体转录组信息，却无法揭示细胞异质性背后的具体贡献者。随着单细胞转录组技术的突破，科学家现在能够以前所未有的分辨率解析组织内部的细胞组成，这为精准定位关键基因的表达模式提供了全新途径。

Mustn1（肌肉骨骼时序激活新基因）作为一个9.2 kDa的微蛋白，自首次在骨再生研究中被发现以来，已在多种脊椎动物的肌肉组织中广泛报道。然而，关于其在其他肌肉骨骼组织（如骨、肌腱等）中的具体细胞定位，特别是与血管系统的关系，仍存在大量未知。近期研究表明Mustn1可能参与细胞外基质重塑过程，这使其在组织修复领域的重要性日益凸显。为了解决这一科学问题，研究团队在《JBMR Plus》上发表了最新研究成果，通过系统性分析开源单细胞数据库，结合实验验证，揭示了Mustn1在肌肉骨骼系统中的细胞表达图谱。

研究人员主要运用了生物信息学分析和实验验证相结合的策略。通过整合人类蛋白图谱、CZ CellxGene Discover、Tabula Muris等大型单细胞数据库，以及GEO数据库中特定组织的单细胞转录组数据集（包括神经元、肌肉、肌腱、骨组织等），采用Seurat和Pegasus等分析工具进行系统评估。实验方面，使用Sox9-CreER^T2、Ai9-tdTomato转基因小鼠模型，通过免疫荧光双标技术对Mustn1和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)进行共定位验证。

Mustn1在神经元和滑膜组织血管周细胞中的表达

通过对背根神经节细胞亚型的分析，发现Mustn1与Acta2、Pdgfrβ和Mcam在血管周细胞簇中共同表达。在血管富集的神经元数据集中，Mustn1和Acta2在动脉和静脉平滑肌细胞中高度共表达。免疫荧光结果证实Mustn1与αSMA在小鼠大脑皮层血管中共定位。在关节炎模型的滑膜组织中，Mustn1和Acta2在血管周细胞中表达最高，免疫染色显示两者在滑膜血管中共表达。

Mustn1与Acta2在骨膜中的强共表达

对p21小鼠长骨的单细胞数据分析显示，Mustn1与Acta2共同定位于骨膜血管周细胞簇。在包含骨髓基质细胞的数据集中，Mustn1表达与Acta2高度相关，主要富集于血管周细胞簇。免疫染色证实Mustn1与αSMA在p28小鼠股骨骨膜血管中共表达，同时在邻近肌纤维中检测到Mustn1信号。

Mustn1在胫骨前肌血管和肌纤维细胞中的表达

综合肌肉单细胞图谱分析显示，Mustn1在平滑肌细胞和血管周细胞中高表达，在内皮细胞和纤维脂肪组祖细胞中表达较低。尽管在部分单核转录组数据中未检测到血管平滑肌细胞的Mustn1表达，但免疫染色明确显示Mustn1与αSMA在肌肉血管中共定位，且在相邻肌纤维中观察到Mustn1信号。这种差异可能源于核内与胞质转录本含量的不同。

肌腱细胞和血管周细胞中的Mustn1表达

在人类前交叉韧带中，Mustn1被鉴定为血管周细胞的差异表达标志基因。在损伤后的人腱周瘢痕组织中，Mustn1与Acta2表达细胞簇高度共表达。小鼠跟腱数据显示Mustn1在血管周细胞中表达最高，在肌腱成纤维细胞中也有表达。免疫染色显示Mustn1在部分肌腱细胞中低表达，而αSMA特异性表达于腱旁组织，两者在腱旁组织血管中共定位。

后肢间充质谱系中肌腱细胞和血管周细胞簇的Mustn1表达

Prx1谱系细胞分析表明，Mustn1在血管周细胞簇中高表达。在Sox9谱系细胞中，Mustn1与肌腱细胞标志物(Scx、Tnmd)在肌腱细胞簇中共表达，同时与Acta2、Mylk和Des在未表征的细胞簇5_5中共同出现。免疫染色显示Mustn1与Sox9谱系在跟腱肌腱细胞中共定位，但在骨骺板软骨细胞中未检测到表达。

这项研究通过多组织、多角度的证据链，证实Mustn1在肌肉骨骼系统中主要表达于血管周细胞群体，且与αSMA的表达呈现高度一致性。这一发现不仅解决了长期以来关于Mustn1细胞定位的争议，更为后续功能研究提供了明确的细胞靶点。特别值得注意的是，在骨骼修复过程中观察到的Mustn1上调现象可能与Sox9/Acta2双阳性骨膜细胞的增殖分化密切相关，这为理解肌肉骨骼再生机制提供了新视角。

研究还揭示了单核与单细胞转录组分析在检测细胞类型特异性表达方面的差异，提示未来研究需根据科学问题选择合适的技术平台。此外，Mustn1在肌腱修复和肾纤维化等病理过程中与肌成纤维细胞分化的潜在关联，预示着该基因可能在更广泛的纤维化疾病中发挥调控作用。

总之，该研究通过创新性地整合多源单细胞数据与实验验证，确立了Mustn1作为肌肉骨骼系统血管周细胞的标志性分子，为开发针对血管周细胞的新型再生治疗策略奠定了理论基础。这些发现将推动肌肉骨骼研究领域更加聚焦于血管微环境在组织修复中的作用，具有重要的科学意义和临床转化价值。