人胚胎干细胞长链非编码RNA遗传筛选揭示多能性新型调控因子

《Stem Cell Reports》：Genetic screening of long non-coding RNAs in human embryonic stem cells reveals novel regulators of pluripotency

本研究通过CRISPRi技术系统性筛选人胚胎干细胞（hESCs）中的长链非编码RNA（lncRNA），鉴定出130余个必需性及150余个生长限制性lncRNA，并揭示其独特的表达模式、基因组结构及进化保守性。进一步发现两个灵长类特异且未表征的必需lncRNA——lncOCT4与lncVRTN，分别通过调控相邻多能性转录因子OCT4（激活p53介导的凋亡）和VRTN（影响细胞命运决定）参与人多能性网络调控。该研究为理解lncRNA在人多能性维持与分化中的功能提供了新视角，对干细胞生物学领域具有重要理论意义。

　　

在人类基因组中，超过98%的DNA序列并不直接编码蛋白质，而是产生大量非编码RNA。其中，长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）近年来被发现在细胞分化、发育调控、疾病发生等过程中扮演关键角色。然而，由于lncRNA种类繁多、功能冗余且缺乏保守性，其具体生物学功能仍有超过90%尚未被解析。尤其在人多能性干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）这一研究早期发育和再生医学的重要模型中，lncRNA如何参与调控多能性网络更是知之甚少。传统基因功能研究手段多针对蛋白质编码基因设计，对lncRNA这类不产生蛋白质的转录本往往束手无策，这成为领域内亟待突破的技术瓶颈。

为系统揭示lncRNA在人多能性维持中的功能，以色列希伯来大学Azrieli干细胞与遗传研究中心的Assa Sherman和Nissim Benvenisty团队在《Stem Cell Reports》上发表了最新研究成果。他们利用CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术，对hESCs中2,965个lncRNA进行了全基因组范围的功能筛选，不仅构建了hESCs中lncRNA的“功能图谱”，还发现了两个新型lncRNA通过调控核心多能性转录因子OCT4和VRTN，深刻影响干细胞命运决定。

研究团队采用CRISPRi技术（利用催化失活的dCas9蛋白与转录抑制因子ZIM3融合构建）对单倍体hESCs细胞系进行遗传筛选，覆盖2,965个lncRNA基因。通过多时间点监测sgRNA丰度变化，结合统计学分析鉴定出对细胞生长具有显著影响的lncRNA。功能验证实验包括siRNA敲低、过表达、转录组测序（RNA-seq）、流式细胞术检测凋亡、亚细胞定位分析、胚胎体（embryoid body）分化实验等。生物信息学分析涉及表达模式、基因组结构、进化保守性、染色体分布等多维度特征评估。

基因组规模筛选揭示hESCs中生长调控性lncRNA

研究人员首先建立了稳定表达ZIM3-dCas9系统的单倍体hESC模型，并利用针对多能干细胞优化的sgRNA文库进行筛选。通过28天的连续培养与深度测序监测，发现超过130个lncRNA为hESCs存活所必需（约占筛选库的4.4%），约150个lncRNA具有生长限制作用（约占5%）。与蛋白质编码基因的必需性分布（偏向必需基因）不同，lncRNA的必需性与生长限制性基因比例接近，反映了lncRNA更倾向于在特定生物学过程中发挥调控功能而非维持基础细胞活动。时序分析显示，阳性hit的sgRNA丰度持续下降，而非靶向对照组保持稳定，证明了筛选结果的可靠性。

生长调控性lncRNA的独特属性

对筛选获得的功能性lncRNA进行深入表征发现，这些基因在hESCs中表达水平显著高于无表型的lncRNA，且在多能状态特异性高表达，分化后迅速下调。在基因组结构上，它们倾向于拥有更多外显子数量和更短的第一外显子，这可能有助于更精细的转录调控。尤为重要的是，生长限制性lncRNA在畸胎瘤组织中表达下调，提示其可能具有抑制肿瘤发生的作用。进化分析显示，功能性lncRNA在灵长类中保守性较高，但在远缘物种（如小鼠）中保守性急剧下降，体现了人类多能性调控网络的物种特异性。染色体分布分析揭示X染色体上必需lncRNA显著缺失而生长限制性lncRNA富集，可能与X染色体失活导致的单等位基因表达有关。

发现核心多能性转录因子的新型lncRNA调控因子

考虑到CRISPRi可能沉默lncRNA邻近基因（影响范围约1kb），研究团队进一步筛选出30个“邻近hit”（其表型可能由相邻编码基因贡献）。从中聚焦两个与关键多能性转录因子OCT4（POU5F1）和VRTN相邻的lncRNA（分别命名为lncOCT4和lncVRTN）。它们位于对应TF基因的反向链上，在多能状态高表达，且在灵长类中保守（小鼠中序列相似性分别降至29.1%和47.7%），提示其可能参与人类特异的多能性调控。

lncOCT4通过调控OCT4表达并诱导p53依赖的凋亡

siRNA敲低lncOCT4引起hESCs快速生长抑制，转录组分析显示凋亡通路显著激活。流式细胞术证实凋亡细胞比例增加，且p53信号通路关键分子上调。在TP53基因敲除的hESCs中，lncOCT4敲低不再诱导凋亡，证明该过程依赖p53通路。表达分析显示lncOCT4与OCT4呈强正相关，敲低lncOCT4降低OCT4表达，而过表达则上调OCT4。机制上，lncOCT4定位于细胞核，且其调控作用不依赖于与OCT4 mRNA的28bp重叠区，提示其可能通过转录调控而非RNA-RNA相互作用发挥作用。

lncVRTN负调控VRTN并影响细胞命运抉择

lncVRTN敲低同样损害hESC生长，并引发细胞周期基因下调与氧化磷酸化（OXPHOS）通路上调——这是细胞退出多能性的典型特征。进一步分析发现中胚层/内胚层标志物及相关信号通路（如NODAL、BMP）激活，提示lncVRTN缺失促进细胞向中内胚层分化。相反，lncVRTN过表达则抑制VRTN表达，并驱动细胞向 formative 多能状态转变（表现为 formative 相关基因激活及XIST重新表达），聚类分析显示其转录谱与 formative 状态细胞更接近。

总结与展望

该研究首次在人多能干细胞中绘制了lncRNA的功能全景图，揭示了其在维持多能性、调控分化命运及潜在肿瘤抑制中的重要作用。发现的lncOCT4和lncVRTN作为核心多能性网络的新型调控元件，不仅丰富了人们对多能性转录调控复杂性的认识，也为理解人类特异性发育机制提供了线索。lncRNA在X染色体上的分布特征及其在物种间的低保守性提示，lncRNA可能是人类多能性调控网络独特性的重要贡献者。未来研究需进一步解析lncOCT4和lncVRTN的具体作用机制（如染色质修饰或转录因子招募），并探索其在早期胚胎发育及干细胞定向分化中的应用潜力。这项工作为干细胞生物学、再生医学及人类发育生物学提供了宝贵的资源与新的研究方向。