CRISPRi筛选揭示阿尔茨海默病中星形胶质细胞远端增强子调控网络

《Nature Neuroscience》：CRISPRi screening in cultured human astrocytes uncovers distal enhancers controlling genes dysregulated in Alzheimer’s disease

本研究利用CRISPRi筛选结合单细胞RNA测序，在人类原代星形胶质细胞中构建了增强子-基因调控网络AstroREG。研究不仅鉴定出158个功能性调控互作，还开发了预测模型EGrf，揭示了调控阿尔茨海默病（AD）相关基因的远端增强子，为理解神经胶质细胞在疾病中的调控机制提供了新视角。

　　

论文解读

在人类基因组中，与复杂性状相关的遗传变异往往位于基因编码区之外的非编码区域，特别是被称为“增强子”的调控元件。这些增强子如同基因的“远程开关”，能够跨越长距离调控基因的表达，从而在细胞功能、发育和疾病中扮演关键角色。然而，尽管通过高通量测序技术已经能够在全基因组范围内预测出大量的候选增强子，但它们在特定细胞类型中的功能状态、调控的具体靶基因以及其与疾病的关联，在很大程度上仍然是一个“黑箱”。

星形胶质细胞是大脑中最丰富的胶质细胞，在调节神经元功能、维持大脑稳态以及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的病理过程中都发挥着至关重要的作用。因此，绘制星形胶质细胞中精确的增强子-基因调控图谱，对于理解大脑功能和解码疾病机制具有极其重要的意义。

为了解决这一挑战，由Nicole F.O. Green和Gavin J. Sutton共同领衔的研究团队在《Nature Neuroscience》上发表了一项重要研究。他们开发了一个名为AstroREG的资源，通过结合CRISPR抑制（CRISPRi）筛选、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和机器学习，首次在人类原代星形胶质细胞中系统地绘制了功能性增强子-基因调控网络。该研究不仅鉴定出调控星形胶质细胞关键功能及阿尔茨海默病相关基因的增强子，还开发了一个高精度的预测模型，极大地扩展了我们对大脑胶质细胞调控机制的认识。

关键技术方法

本研究首先从PsychENCODE数据库中筛选了979个位于基因间区的候选增强子，这些区域在星形胶质细胞中具有开放的染色质状态。随后，研究人员构建了一个包含2478个sgRNA的CRISPRi文库，并将其导入稳定表达dCas9-KRAB的人类原代星形胶质细胞（NHAs）中。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，他们同时捕获了每个细胞的sgRNA信息和全转录组表达谱。利用SCEPTRE算法进行差异表达分析，最终鉴定出145个功能性增强子调控了116个基因，形成了158个增强子-基因调控对（EGPs）。这些实验验证的调控互作被用作“金标准”数据，用于训练一个名为EGrf的随机森林（RF）模型，该模型能够高特异性、高精度地预测全基因组范围内的增强子-基因调控互作。

研究结果

CRISPRi筛选鉴定星形胶质细胞中的功能性增强子

研究人员首先对筛选出的979个候选增强子进行了功能验证。通过CRISPRi筛选，他们成功鉴定出145个功能性增强子，这些增强子调控了116个基因，共形成了158个增强子-基因调控互作。其中，84.1%的互作导致了靶基因表达的下调，这与CRISPRi的抑制功能一致。值得注意的是，大多数功能性增强子只调控一个基因，而大多数基因也只被一个增强子调控，但研究也发现了一些复杂的调控位点，例如一个基因最多可被五个不同的增强子调控。通过独立的NanoString和qRT-PCR验证实验，研究人员证实了这些调控互作的可靠性，表明CRISPRi筛选结果具有高度的可重复性。

功能性增强子的基因组与转录组特征

为了深入理解这些功能性增强子的特性，研究人员对其进行了多组学分析。他们发现，功能性增强子通常调控远端基因，76%的调控互作发生在200 kb的距离内。虽然增强子调控其最近基因的概率显著高于随机水平，但只有38.6%的互作涉及最近基因，其余则跨越了多个基因调控更远端的靶点。此外，73.1%的功能性增强子本身是转录活跃的，能够产生增强子RNA（eRNA），且其转录水平显著高于非功能性候选区域。通过分析不同细胞类型和发育阶段的染色质可及性数据，研究人员还发现，功能性增强子表现出显著的细胞类型特异性和发育阶段特异性，这进一步印证了其在星形胶质细胞特定功能中的重要作用。

构建星形胶质细胞特异性调控网络

为了揭示调控星形胶质细胞基因表达的核心回路，研究人员整合了CRISPRi筛选数据、ATAC-seq足迹分析以及转录因子（TF）表达数据，构建了一个星形胶质细胞特异性的调控网络。该网络包含了19个星形胶质细胞特异性增强子调控18个特异性基因，以及36个结合在这些增强子上的星形胶质细胞特异性转录因子。值得注意的是，AP1复合物组分FOS和JUN在静息状态的星形胶质细胞中高表达，并显示出对星形胶质细胞特异性增强子的强结合能力，揭示了它们在维持星形胶质细胞身份中的基础性作用。通过整合ChIP-seq数据，研究人员进一步验证了该网络中72%的转录因子-增强子互作，为调控网络的可靠性提供了有力支持。

鉴定调控阿尔茨海默病相关基因的增强子

为了评估这些增强子-基因调控互作的疾病相关性，研究人员进行了富集分析。他们发现，被增强子调控的基因在阿尔茨海默病（AD）相关的基因集中显著富集。具体而言，在158个实验验证的调控互作中，有100个涉及与AD神经病理学特征或认知功能相关的基因。例如，研究人员鉴定出三个不同的增强子调控LGALS3基因的表达，该基因编码的Galectin-3蛋白在AD病理中扮演重要角色。此外，他们还发现了一个调控CCL2基因的增强子（Enh427），该基因在AD星形胶质细胞中表达失调，且该增强子区域包含了与AD相关的遗传变异。这些发现将星形胶质细胞的远端调控元件与AD的分子病理直接联系起来。

开发高精度增强子-基因互作预测模型EGrf

鉴于现有基于癌细胞系（如K562）开发的预测模型在星形胶质细胞中表现不佳，研究人员利用CRISPRi筛选获得的“金标准”数据，开发了一个名为EGrf的随机森林模型。该模型整合了增强子染色质状态（H3K27ac、H3K4me3、ATAC-seq）、基因稳定性指数、增强子-基因距离等多个特征。结果显示，EGrf模型在星形胶质细胞中的预测精度显著优于现有模型（如ABC、TAP-seq RF、rE2G等）。在80%的精确度阈值下，EGrf在全基因组范围内预测了1348个高置信度的增强子-基因调控互作，极大地扩展了星形胶质细胞的调控图谱。通过独立的CRISPRi实验验证，研究人员证实了EGrf预测的调控互作具有很高的可靠性。

研究结论与讨论

本研究通过CRISPRi筛选，在人类原代星形胶质细胞中构建了一个高置信度的功能性增强子-基因调控资源AstroREG。该研究不仅揭示了星形胶质细胞中远端增强子调控的复杂性，还发现这些调控元件与阿尔茨海默病等神经系统疾病密切相关。更重要的是，研究开发的EGrf模型克服了现有模型在非癌细胞类型中泛化能力不足的问题，为在星形胶质细胞中进行全基因组范围的调控互作预测提供了有力工具。

该研究的一个关键发现是，大多数由CRISPRi鉴定的调控互作并未被现有的脑组织表达数量性状基因座（eQTL）数据所捕获。这提示我们，eQTL分析可能主要捕捉的是效应较大的启动子附近变异，而CRISPRi筛选则能够揭示那些效应较小或具有高度细胞类型特异性的远端调控互作。因此，将功能基因组学筛选与遗传学数据相结合，对于全面理解非编码变异在疾病中的作用至关重要。

总之，这项研究为理解星形胶质细胞在健康和疾病状态下的基因调控机制提供了宝贵的资源和新的见解。它不仅鉴定了一系列与阿尔茨海默病相关的功能性增强子，为疾病机制研究和潜在的治疗靶点开发指明了方向，还建立了一个可推广的研究框架，可用于在其他细胞类型中系统地绘制功能性的增强子-基因调控网络。