《Journal of Chromatography A》：Dual-targeting Immunoadsorbent Employing a Bispecific Nanobody for the Simultaneous Removal of IL-6 and TNF-α from Serum
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本研究开发了一种基于双特异性纳米抗体的免疫吸附剂，可同时高效特异性捕获IL-6和TNF-α。该吸附剂在模拟血液净化系统中表现出85%以上的去除效率，且能从复杂血清基质中有效分离两种细胞因子。采用原核系统表达并偶联到Sepharose CL-6B载体，证实其高饱和吸附容量（IL-6:6.9 mg/mL，TNF-α:2.2 mg/mL）和快速结合动力学，为精准治疗炎症风暴相关疾病提供了新策略。
冯向轩|王瑶辉|王一帆|任军
中国大连理工大学生物工程学院，生物智能制造教育部重点实验室，分子识别与成像辽宁重点实验室，大连，116024
摘要
炎症因子（如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过度产生是严重炎症性疾病的特征。体外血液净化提供了一种有前景的治疗策略，但现有的吸附剂往往缺乏精确干预所需的特异性。本研究报道了一种基于双特异性纳米体（bsNb）的免疫吸附剂，用于同时特异性地去除IL-6和TNF-α。这种功能性bsNb通过原核系统串联融合产生，并通过共价键固定在Sepharose CL-6B基质上，制备成亲和吸附剂。全面表征显示其具有高饱和吸附能力（IL-6为6.9 mg/mL，TNF-α为2.2 mg/mL）和快速的结合动力学。在用人血清模拟的血灌流系统中，该吸附剂对这两种细胞因子的去除效率超过85%，且能够在多种病理生理浓度范围内发挥作用。重要的是，bsNb吸附剂能够有效地从复杂的血清基质中同时捕获这两个目标。这项工作突显了双特异性纳米体作为制备靶向免疫吸附剂的强大且选择性的配体的巨大潜力。所开发的平台是非特异性吸附剂的优越替代品，为针对细胞因子驱动的炎症性疾病提供更精确和有效的外体疗法铺平了道路。
引言
脓毒症和细胞因子释放综合征（CRS）是危及生命的系统性炎症状态，通常由严重感染或免疫治疗引发，其特征是“细胞因子风暴”的失调[1,2]。在这种过度炎症级联反应中，促炎细胞因子（特别是白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为早期和核心介质发挥关键作用。它们导致发热、血管扩张、毛细血管渗漏，并最终引发多器官功能障碍综合征（MODS）[3,4]。因此，迅速有效地从循环系统中去除这些致病细胞因子已成为一种有前景的治疗策略，与常规治疗方法相结合。血液净化技术（如血灌流）提供了一种直接的外体方法来减轻细胞因子风暴，可能通过恢复免疫稳态来改善患者预后[5,6]。吸附血液净化在临床环境中已被广泛用于去除各种有毒物质。非特异性吸附剂（如活性炭和中性大孔树脂）已成功用于治疗药物中毒[7]。也开发了更具选择性的吸附剂，例如用于肝衰竭时结合胆红素的吸附剂和用于去除类风湿性关节炎等自身免疫疾病中的致病自身抗体的固定化蛋白A[8,9]。然而，由于细胞因子的血浆浓度极低（每毫升皮克到纳克范围），在大量高丰度蛋白质的背景下，高效捕获细胞因子是一个独特的挑战。虽然像CytoSorb血灌流盒这样的非特异性吸附剂依靠疏水相互作用显示出一定的降低细胞因子水平的能力，但其作用方式是非选择性的[10]。这种缺乏特异性的情况会导致有益分子（包括必需激素、凝血因子甚至治疗药物）的同时被去除，可能产生意外的副作用[11]。因此，开发对目标细胞因子具有高特异性的亲和吸附剂对于实现精确和安全的血液净化至关重要。
纳米体（Nb）是从骆驼科动物中提取的仅含有重链的可变域抗体，作为出色的亲和配体受到了广泛关注[12]。它们的优点包括小尺寸（约15 kDa）、高稳定性、优异的溶解性以及在微生物系统中易于重组生产[13][14][15]。这些特性使纳米体成为构建强大且高效亲和层析介质的理想候选者[16]。它们的单域性质允许进行简单的基因工程改造，创建多功能形式（如二价或双特异性结构），可以定点固定在固体支持物上，以最大化配体密度和结合亲和力[17]。
尽管已经探索了一些针对个别细胞因子的基于Nb的配体[18]，但细胞因子网络的复杂性和协同作用需要多靶点方法。IL-6和TNF-α在脓毒症和CRS的发病机制中都起着关键作用[19,20]，并且在临床前模型中显示同时阻断这两种因子具有协同治疗效果。然而，简单地混合两种不同的单特异性吸附剂在操作上非常复杂，需要单独的生产和纯化过程，这增加了制造步骤并使质量控制变得复杂。相比之下，通过共表达产生的单一双特异性配体提供了简化的流程，确保了产品的均一性并减少了批次间的差异，这对于开发稳健且一致的医疗设备至关重要。
在这里，我们报道了一种新型免疫亲和吸附剂的设计和评估，用于从人血清中选择性捕获IL-6和TNF-α。使用通过串联融合两种高亲和力的Nbs（针对IL-6和TNF-α）工程化的重组双特异性纳米体（bsNb）作为亲和配体。这种bsNb经过异源表达、纯化，然后固定在琼脂糖珠上。彻底表征了bsNb对这两种目标的亲和力。评估了所得免疫吸附剂在人血清中添加的细胞因子方面的结合能力和选择性。
材料
表达IL-6和TNF-α纳米体的pET-21a质粒由大连康源医疗科技有限公司（中国）提供。IL-6和TNF-α标准品购自武汉华美生物工程有限公司（中国）。BCA蛋白测定试剂盒、人IL-6和人TNF-α ELISA试剂盒、氨苄西林（Amp）、异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃苷（IPTG）、20×PBS缓冲液以及微生物培养相关试剂（如酵母提取物和蛋白胨）均购自Solarbio（北京，中国）。生化试剂
双特异性纳米体（bsNb）的设计、表达和纯化
串联表达是制药行业中构建多特异性纳米体的便捷且广泛采用的策略。在本研究中，我们开发了一种同时针对IL-6和TNF-α的bsNb。针对IL-6和TNF-α的单价纳米体的亲和力和可溶性表达已在我们的先前工作中得到充分验证[21]，作为构建块。为了最小化串联融合和后续固定对活性的潜在负面影响结论
在这项工作中，我们开发了一种基于双特异性纳米体的新型亲和吸附剂，用于特异性和同时去除IL-6和TNF-α。bsNb被高效表达并固定在Sepharose CL-6B上，获得了对这两种目标都具有高结合能力和快速动力学特性的吸附剂。重要的是，该吸附剂在模拟临床血灌流条件的血清循环模型中表现出优异的性能，有效地将这两种细胞因子降低到低水平。
CRediT作者贡献声明
冯向轩：研究、数据分析、撰写——审阅与编辑。王瑶辉：研究、方法学、撰写——初稿。王一帆：方法学、数据分析。任军：概念化、撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。
CRediT作者贡献声明
冯向轩：撰写——审阅与编辑、研究、数据分析。王瑶辉：撰写——初稿、方法学、研究。王一帆：方法学、数据分析。任军：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢中国国家重点技术研发计划（2021YFC2103401）和中央高校基本科研业务费（DUT24YG140）的资助。
