综述：质子化与蛋白质折叠：来自单分子荧光的洞察

《Biophysical Chemistry》：Protonation and protein folding: Insights from single-molecule fluorescence

蛋白质折叠与质子化高度相关，电荷状态变化影响局部电环境及有效pKa值，进而调控折叠路径和功能多样性。单分子荧光技术（如smFRET、荧光寿命分析）能捕捉传统方法忽略的中间体、异质子群及瞬态事件，揭示质子化与折叠动力学的内在联系，为疾病治疗和生物材料设计提供新策略。

　　
蛋白质折叠与质子化动态的协同作用机制研究综述

蛋白质折叠作为生命科学的核心课题，其研究范式正经历从传统 ensemble 方法向单分子水平的技术革新。近年来，质子化动态与蛋白质折叠的耦合机制成为该领域的研究热点，揭示了电荷调控在构象转变中的关键作用。本综述系统整合了质子化效应影响蛋白质折叠路径的分子机制，重点阐述单分子荧光技术（SMF）在揭示微观质子化事件与宏观功能调控之间的关联性方面的突破性进展。

质子化动态通过三重作用机制影响蛋白质折叠过程：首先，可离子化残基的质子化状态改变局部静电场分布，重塑氢键网络构象空间；其次，pKa值的动态波动引发溶剂化环境重构，形成不同的过渡态中间体；最后，电荷重排诱导的分子内相互作用网络调控折叠能垒与路径选择。这种多尺度耦合效应使得传统 ensemble 研究难以捕捉质子化驱动的构象多样性，而单分子荧光技术通过直接观测单个蛋白质分子的动态行为，为揭示折叠-质子化耦合机制提供了全新视角。

在实验方法学层面，单分子荧光技术体系已形成完整的研究框架。单分子 F?rster 距离转移（smFRET）技术能够以纳米精度追踪质子化敏感残基的空间位置变化，其时间分辨率可达皮秒级，可有效捕捉传统方法无法观测的亚稳态中间体。荧光寿命分析技术通过监测荧光分子在激发态的存活时间，实现了对局部极性环境变化的超敏感检测，其分辨率可达飞秒量级。溶质色散探针技术则巧妙利用质子化诱导的溶剂化层重构效应，通过荧光波长位移构建三维质子化分布图。结合微流控技术的 pH 跳变实验，可在亚秒时间内实现溶液pH值的精确调控，为研究质子化驱动的构象动力学提供了可控的实验平台。

研究案例显示，质子化调控机制具有广泛的生物学意义：在真核生物中，组氨酸富含区通过质子化状态感知细胞内pH波动，动态调节酶活性中心的构象；在病毒包膜融合过程中，质子化触发剂（如流感病毒HA蛋白）通过质子转移诱导膜蛋白从预成构象向激活构象转变，实现宿主细胞膜的选择性穿透；工程化设计中，pKa 值调控的分子开关已成功应用于开发pH响应型生物材料，其功能切换效率可达毫秒级。

值得注意的是，质子化驱动的折叠动力学具有显著的时间尺度特性。超快质子转移（<100 fs）与构象调整（~1 μs）形成时空协同效应，这种时间分辨特性为揭示折叠中间体的构象异质性提供了实验依据。理论模拟方面，恒定pH分子动力学（CpH-MD）通过动态调整残基质子化状态，成功预测了质子化敏感区域的折叠自由度。但现有模型在模拟溶剂化层重构对质子转移速率的影响方面仍存在局限性，这成为当前研究的核心挑战。

未来发展方向聚焦于三个关键领域：其一，开发具有亚毫秒时间分辨率的质子化检测技术，解决现有方法在快速质子转移事件观测中的空白；其二，构建多尺度理论模型，整合量子力学计算（处理氢键网络重构）与分子动力学模拟（解析构象动力学），建立从原子水平到亚细胞尺度的跨尺度预测体系；其三，拓展单分子荧光技术的应用场景，包括开发基于质子化调控的智能药物递送系统，以及设计具有pH记忆效应的生物传感器。

该研究领域的突破将推动蛋白质工程和疾病治疗的范式转变。在病理机制研究中，阿尔茨海默病β淀粉样蛋白的异常折叠与谷氨酸残基的质子化状态变化存在显著相关性，单分子荧光追踪技术已能捕捉到病理态蛋白中质子化驱动的不规则折叠环。在生物材料开发方面，基于质子化调控的分子马达已被成功整合到人工酶系统中，实现pH梯度驱动的定向分子运输。

当前研究存在三个主要局限：首先，质子化状态检测技术的时间分辨率与空间精度仍需提升；其次，多组学数据整合不足，未能充分建立质子化动态与蛋白质折叠自由能面的定量关系；最后，实验方法与理论模型的协同优化机制尚未形成标准化流程。这些瓶颈问题的突破将依赖于跨学科技术的深度融合，包括超快光谱学、冷冻电镜与人工智能预测模型的整合应用。

总之，质子化-折叠耦合机制的研究正在重塑蛋白质科学的理论框架。单分子荧光技术的引入不仅解决了传统方法无法观测的微观动态问题，更重要的是建立了从分子基团质子化状态到蛋白质整体构象功能的跨尺度调控模型。这种研究范式的革新为开发新一代生物技术器件（如pH响应型药物载体、自修复蛋白质材料）提供了理论支撑和技术路线。随着高灵敏质子化探针（如表面等离子体共振探针）和人工智能辅助的分子动力学模拟（如机器学习驱动的自由能面计算）的技术进步，该领域有望在五年内实现从基础研究到临床应用的转化突破。