《Biophysical Chemistry》：The effect of lipid saturation on the formation of styrene maleic acid lipid nanoparticles
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本研究探讨不同饱和度脂质（DOPC、POPC、DPPC、DMPC）与两种SMA聚合物（3:1和2:1摩尔比）对SMA脂质纳米圆盘（SMALPs）形成及膜蛋白构象的影响。结果表明，SMA亲水尾长度和脂质饱和度显著影响纳米圆盘形成效率及膜蛋白空间排布，其中2:1 SMA在低脂质比例下即可有效形成纳米圆盘，而3:1 SMA需更高比例以完全溶解不饱和脂质膜。DLS和EPR分析证实亲水尾插入膜脂双层中调控蛋白定位。
艾玛·A·戈登（Emma A. Gordon）|伊芙琳·A·奥科拉福尔（Evelyn A. Okorafor）|因德拉·D·萨胡（Indra D. Sahu）|凯文·M·伯里奇（Kevin M. Burridge）|穆罕默德·齐尚·沙阿（Muhammad Zeeshan Shah）|奥尼莎·塔帕（Onisha Thapa）|多米尼克·康科莱维茨（Dominik Konkolewicz）|加里·A·洛里根（Gary A. Lorigan）
美国俄亥俄州牛津市迈阿密大学化学与生物化学系，邮编45056
摘要
利用苯乙烯马来酸（SMA）溶解膜蛋白的能力一直备受关注。无需使用洗涤剂即可形成脂质纳米盘并提取蛋白质，从而能够在更接近天然状态的环境中研究这些膜蛋白。传统的模拟系统（如胶束、双胶束和脂质体）在为蛋白质提供天然环境方面存在兼容性限制。脂质组成对这些模拟系统与膜蛋白的兼容性起着重要作用。本研究使用不同饱和度的脂质来评估SMA聚合物形成苯乙烯马来酸脂质纳米颗粒（SMALPs）的效果。实验中使用了从完全饱和到完全不饱和的各种脂质，以及具有不同疏水链长度的两种SMA聚合物。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对脂质体和SMALPs进行了表征。连续波电子顺磁共振光谱（CW-EPR）用于研究SMA对掺入SMALP系统的自旋标记膜蛋白的影响。结果表明，掺入SMALPs的膜蛋白的动态性质取决于SMA聚合物的链长度以及脂质的饱和度。线形分析表明，SMA的疏水链在蛋白质在SMALPs中的定位方式中起作用。
引言
近年来，苯乙烯马来酸（SMA）在膜蛋白溶解领域引起了广泛关注[1]。SMA可以在不使用洗涤剂的情况下将膜溶解成纳米盘。使用SMA可以在保持天然脂质环境的同时纯化膜蛋白，从而避免了使用洗涤剂可能带来的问题（如蛋白质聚集和变性[2,3]）。苯乙烯马来酸脂质纳米颗粒（SMALPs）的形成具有优势，因为这些纳米盘体积小且均匀，可以通过多种生物物理技术对其进行表征[4]。常见的膜模拟系统包括胶束、双胶束、脂质体和由膜支架蛋白（MSPs）制成的纳米盘[5],[6],[7],[8],[9],[10]。每种系统在研究膜蛋白时都有其局限性，因此SMALPs成为一种可行的替代模拟系统。最近使用SMA的研究报告称，该系统在模拟脂质方面具有更高的准确性[11,12]。纳米盘的形成有助于稳定和均一化脂质环境。这些纳米盘已通过透射电子显微镜（TEM）[13,14]、核磁共振（NMR）[15,16]、动态光散射（DLS）[17,18]和电子顺磁共振（EPR）[19],[20],[21],[22]等手段进行了表征。
尽管人们对使用SMA进行膜溶解很感兴趣，但关于纳米盘形成的机制仍知之甚少。如先前报道的那样[23]，这一过程分为三个步骤：首先SMA与脂质膜结合；这一步受SMA的用量、溶液中阴离子的存在以及脂质头基的电荷影响；其次SMA的疏水链嵌入双层的疏水区域；这一步受到膜流动性、侧向压力、脂质排列和双层厚度的显著影响；最后膜被溶解并形成纳米盘。
先前的研究表明，薄膜、较低的侧向压力、较低的脂质电荷密度以及较高的盐浓度可以促进溶解机制[24,25]。这些研究得出结论，SMA不会区分不同类型的脂质，膜溶解可能是由疏水效应驱动的。虽然脂质类型不影响纳米盘形成的最终结果，但本研究发现，与完全饱和的脂质相比，含有不饱和链的脂质的溶解效率较低[24]。此外，SMA中疏水链的长度（3:1或2:1）也会影响形成的纳米颗粒的大小[18],[26],[27],[28]。本研究还发现，尽管纳米盘的形成与SMA聚合物的分子量无关，但其大小取决于苯乙烯与马来酸的摩尔比。
在本研究中，我们旨在了解脂质双键饱和度如何影响SMALPs的形成，以及两种不同苯乙烯与马来酸摩尔比的SMA聚合物之间的差异。实验使用了四种不同饱和度的脂质：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DOPC）、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（POPC）、二棕榈酰磷脂胆碱（DPPC）和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DMPC）。DOPC为完全不饱和脂质，POPC含有一个不饱和的乙酰链，而DPPC和DMPC为完全饱和脂质。实验中使用了通过RAFT聚合反应合成的3:1和2:1比例的SMA[15,29]。通过动态光散射（DLS）实验表征了添加SMA后形成的SMALPs。连续波电子顺磁共振光谱（CW-EPR）用于分析含有膜蛋白的SMALPs。
实验部分
囊泡制备
囊泡样品由DOPC、POPC、DPPC或DMPC组成。将粉末状脂质溶解在氯仿中，并蒸发在心形烧瓶的一侧形成薄膜。样品在真空干燥器中过夜干燥。然后将脂质薄膜悬浮在含有100 mM NaCl和20 mM HEPES（pH 7.0）的缓冲液中，最终浓度为100 mM。溶液经过多次冻融循环以形成脂质体。通过DLS实验确认了囊泡的大小。
苯乙烯马来酸共聚物的合成
结果与讨论
图1A展示了用于制备囊泡和SMALPs的脂质的化学结构。选择了具有不同饱和度和不饱和度的脂质，以研究不同类型脂质在SMALP形成过程中的差异。DOPC为完全不饱和脂质，含有两个不饱和的乙酰链；POPC含有一个饱和和一个不饱和的乙酰链；DPPC和DMPC都含有两个完全饱和的乙酰链。
结论
SMA是一种高效的膜溶解剂[1,11,23,51]。数据显示，脂质饱和度会影响SMA形成纳米盘的效果，具体取决于聚合物疏水链的长度。对于所有脂质而言，2:1比例的SMA形成的SMALPs的囊泡与SMA的体积比（v/v）最低，为1:0.5。3:1比例的SMA也能形成SMALPs，但含有不饱和链的脂质需要更高的囊泡与SMA体积比才能完全溶解。
作者贡献声明
艾玛·A·戈登（Emma A. Gordon）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据管理、概念构思。
伊芙琳·A·奥科拉福尔（Evelyn A. Okorafor）：撰写——审稿与编辑、数据分析。
凯文·M·伯里奇（Kevin M. Burridge）：方法设计、数据管理。
穆罕默德·齐尚·沙阿（Muhammad Zeeshan Shah）：数据分析。
多米尼克·康科莱维茨（Dominik Konkolewicz）：数据可视化、资金争取、概念构思。
加里·A·洛里根（Gary A. Lorigan）：撰写——审稿与编辑、资金争取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本项工作得到了NIGMS/NIH“最大化研究者研究奖（MIRA）”（授予G.A.L.，项目编号R35 GM126935）的支持，用于脂质分析。聚合物的开发与分析得到了NIGMS/NIH项目编号1R15GM144907-01A1的资助。因德拉·D·萨胡（Indra D. Sahu）感谢美国国家科学基金会（NSF）（项目编号MCB-2523371）的支持。作者还感谢迈阿密大学中央先进显微仪器设施（CAMI）提供的支持。
