《Atherosclerosis》：Integrated high-throughput miRNomics and lipidomics in mice with altered lipoprotein metabolism
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本研究通过整合miRNA组学与脂质组学数据，系统分析了C57BL/6、Ldlr?/?和Pcsk9?/?三种小鼠模型在不同饮食下的miRNA表达与脂质代谢的关联，发现miR-431-5p和miR-677-5p等新miRNA可能参与胆固醇和甘油三酯的调控。该研究首次建立miRNA与脂质代谢的跨组学关联网络，为心血管疾病治疗提供新靶点。
斯特凡诺·曼齐尼（Stefano Manzini）| 艾丽丝·科伦坡（Alice Colombo）| 埃尔莎·弗兰基（Elsa Franchi）| 吉亚达·波莱蒂（Giada Poletti）| 马可·布斯内利（Marco Busnelli）| 朱莉娅·基耶萨（Giulia Chiesa）
米兰大学药理学与生物分子科学系“罗多尔福·帕奥莱蒂”（Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences “Rodolfo Paoletti”），意大利米兰巴尔扎雷蒂街9号（via Balzaretti 9），邮编20133
摘要
背景与目的
为了增进我们对miRNA与脂质之间相互作用的理解（目前这一领域仍较为有限），本研究采用了一种新的方法，整合了从具有特定脂质特征的小鼠中收集的miRNA组学（miRNomic）和脂质组学（lipidomic）数据。
方法
研究首先对野生型小鼠、Pcsk9基因敲除小鼠以及Ldlr基因敲除小鼠进行了miRNA组学和脂质组学分析，这些小鼠分别被喂食正常实验室饮食或西方饮食。在肝脏、主动脉、白色脂肪组织、十二指肠、空肠和大脑中进行了miRNA的高通量测序；同时利用高通量质谱技术对肝脏、主动脉和血浆中的脂质进行了定量分析。检测了不同样本中miRNA表达水平与脂质浓度之间的相关性，并根据严格的筛选标准筛选出显著的相关性。随后在鼠肝癌细胞中通过体外实验（in vitro）验证了这些相关性。
结果
通过分析不同实验条件下miRNA表达水平与脂质浓度之间的相关性，筛选出了可能在脂质调节中起重要作用的miRNA。这些相关性主要出现在肝脏组织中。在选定的miRNA中，有些已知与脂质代谢相关（如miR-33、miR-210和miR-21a），而其他一些miRNA（包括miR-431-5p、miR-434-3p、miR-434-5p和miR-677-5p）此前尚未被证实与脂质组异常有关。体外实验表明miR-431-5p和miR-677-5p可能在总胆固醇和甘油三酯浓度的调节中发挥作用。
结论
本研究将miRNA组学和脂质组学数据相结合，揭示了某些新的miRNA在脂质调节中的潜在作用。
引言
脂质在生物功能中起着关键作用。除了作为细胞膜成分外，它们还储存能量，并可作为生物活性代谢物的前体；近年来，脂质还被视为重要的生物标志物[1]、[2]、[3]。多项研究表明，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高是动脉粥样硬化的主要诱因[4]、[5]。胆固醇及其他脂质在大动脉内皮下的逐渐积累是动脉粥样硬化斑块形成的基础，而动脉粥样硬化是导致心血管疾病（CVD）的主要因素之一，是全球主要的健康问题[6]。因此，“脂质组学”技术的发展——即对复杂生物样本中各种脂质成分的定量分析——使我们能够从临床和临床前模型中识别出数百种脂质[7]、[8]、[9]，并将其与病变的特定特征（如稳定区和不稳定区）联系起来[10]。此外，血浆脂质组分析还有助于对CVD患者进行风险分层[11]、[12]。
脂质代谢受到严格调控：除了经典的转录调控机制外，miRNA也被证实是脂质代谢基因的强大调节因子[13]、[14]。
miRNA是一类小型非编码单链RNA，可作为基因表达的转录后调节因子[15]。一个miRNA理论上可以调控超过100个不同的基因[16]。多项研究指出miRNA在脂质代谢调节及动脉粥样硬化发展中的作用，它们既可作为生物标志物[17]，也可能是潜在的治疗靶点[18]。尽管早期研究显示出巨大潜力，但我们对miRNA在维持脂质稳态中的调控作用仍了解有限。
在当前的“组学”研究中，往往缺乏一种全局性的方法来理解miRNA与表型之间的复杂相互作用——即分子机制的最终体现。
在本研究中，我们整合了三种不同基因型小鼠多个器官/组织的miRNA组学和脂质组学数据，这些小鼠分别被喂食两种不同的饮食[19]、[20]。三种基因型分别为：作为对照组的C57Bl/6小鼠；低密度脂蛋白受体（Ldlr-/-）敲除小鼠；以及前蛋白转化酶亚基丝氨酸蛋白酶/凯克辛9（Pcsk9-/-）敲除小鼠。Ldlr和PCSK9均参与LDL的代谢过程，前者促进LDL的清除[21]，后者导致Ldlr蛋白的降解[22]。因此，Ldlr-/-小鼠在喂食西方饮食后会出现高胆固醇血症并易患动脉粥样硬化[23]；相反，Pcsk9-/-小鼠则表现为低胆固醇血症且具有抗动脉粥样硬化能力[24]。
为了发现参与脂质代谢的新miRNA，我们将各器官/组织中miRNA的表达情况与血浆、主动脉和肝脏中测得的各类脂质或特定脂质的浓度进行了关联分析。在那些与脂质具有最多相关性的miRNA中，有些此前尚未被证实与脂质代谢有关。
材料与方法
使用的动物模型及组织取样：所有体内实验均获得了意大利卫生部的批准（授权编号04/2012），并严格遵循了机构、国家和国际的相关法律法规。
C57BL/6J对照组小鼠（野生型；RRID:IMSR_JAX:000664），低密度脂蛋白受体基因（Ldlr-/-）纯合敲除小鼠；以及前蛋白转化酶亚基丝氨酸蛋白酶/凯克辛9基因（Pcsk9-/-）纯合敲除小鼠（RRID:IMSR_JAX:005993）。
结果
miRNA表达与脂质水平之间的相关性：首先对所有可能的器官/组织和基因型间的miRNA与脂质水平相关性进行了无监督分析，分别考虑了仅喂食NLD饮食的小鼠、仅喂食WD饮食的小鼠以及同时喂食NLD和WD饮食的小鼠。基于初步筛选标准，进一步筛选出可能在脂质调节中起重要作用的miRNA。
讨论
本研究发现了某些此前未在脂质调节领域被研究的miRNA，这些miRNA可能在脂质代谢中发挥作用。这一发现得益于将之前进行的多种组学分析结果进行关联：包括主动脉、血浆和肝脏的脂质谱[20]，以及与脂质代谢相关的多个器官（如主动脉、肝脏、白色脂肪组织和小肠段[19]）的miRNA表达谱。
作者贡献
斯特凡诺·曼齐尼（Stefano Manzini）：概念构思、方法设计、软件开发、数据验证、数据分析、论文撰写及可视化；艾丽丝·科伦坡（Alice Colombo）：方法设计、实验研究；埃尔莎·弗兰基（Elsa Franchi）：实验研究；吉亚达·波莱蒂（Giada Poletti）：实验研究；马可·布斯内利（Marco Busnelli）：概念构思、实验研究、论文撰写及审稿编辑；朱莉娅·基耶萨（Giulia Chiesa）：论文撰写、审稿编辑、项目监督及资金申请
利益冲突
作者声明：他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
资金支持
本项目得到了卡里普洛基金会（Fondazione Cariplo，项目编号2011-0645，G. Chiesa）、欧盟“地平线欧洲”（Horizon Europe）研究与创新计划（项目编号101057724 - LiverTarget，G. Chiesa）、欧盟“地平线2020”研究与创新计划（ERA-Net Cofund项目编号727565，OCTOPUS项目，G. Chiesa）以及意大利教育部（MIUR）“卓越计划”（Progetto Eccellenza）的资助。此外，该项目还获得了2021年和2022年意大利研究支持计划（Piano Sostegno alla Ricerca，项目编号2和2）的支持。
利益冲突声明
作者声明：他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢米兰大学（Federico Ambrogi教授）、米兰大学（Elena Olmastroni博士）、罗马3大学（Alessandro Giuliani教授）以及坦佩雷大学（Emma Raitoharju博士）提供的宝贵建议；同时感谢Elda Desiderio Pinto、Luana Cremascoli和Roberta De Santis在行政工作上的协助。
