内部引物阻断剂可抑制LAMP反应中的非特异性扩增

《Analytica Chimica Acta》：Inner primer Blockers inhibit non-specific amplification in LAMP

针对环介导等温扩增（LAMP）中普遍存在的非特异性扩增（NSA）问题，本研究通过设计特异性阻滯剂（Blockers）靶向内引物-外引物（IIP-OIP）复合结构，成功抑制NSA。实验发现IIP是NSA的主要诱因，添加长度为-3和-6的阻滯剂可显著降低NSA发生率，同时优化检测灵敏度，在低模板浓度下实现更精准的病毒载量检测。该策略为LAMP诊断的标准化提供了新思路。

　　

莫一迪|朱娟|黄彦琳|胡静静|苏志坚|张长斌

中国广州市511442，广东省妇女儿童医院医学遗传中心

摘要

背景

环介导等温扩增（LAMP）中非特异性扩增（NSA）的频繁发生严重限制了其广泛应用。当模板量过低或完全缺失时，可能会随机产生NSA产物，导致检测结果不可靠且不准确。NSA的机制尚未得到充分阐明，因此现有的缓解策略未能从根本上解决问题，效果不佳。

结果

使用三种已发表的引物组和三种常规设计的引物组进行了无模板（仅引物）实时LAMP检测。所有反应均显示出可检测的NSA，从而支持了引物是NSA主要来源的假设。对两组代表性引物组进行了全面分析，包括在无模板条件下使用单个引物和多种引物组合（从两个到六个引物）的反应，这一过程称为引物“SCAN”分析。这些系统的研究表明，每组引物中至少存在一个能够独立引发NSA的启动内引物（IIP）。IIP始终在最有效的NSA扩增组合中被识别出来，并成为不希望发生的扩增事件的主要驱动因素。重要的是，引入专门针对IIP的F1c/B1c序列的未扩增寡核苷酸抑制剂显著抑制了NSA，同时保持了原有的结合特异性，证明了靶向抑制策略的有效性和选择性。仅添加一个或两个抑制剂就能显著抑制NSA。-3和-6抑制剂在抑制NSA和保持所需反应效率之间实现了最佳平衡，通过延长无NSA间隔实现了这一点。在某些使用-6抑制剂的组中，检测限（LOD）得到提高，大大增强了在感染早期检测低病毒载量样本的准确性。

意义

本研究证实，某些内引物，特别是IIP，在LAMP中引发NSA过程中起着关键作用。抑制剂有潜力成为有效抑制LAMP诊断中NSA的通用策略。通过延迟引物引发的NSA的阳性时间（TTP），可以在传统的检测时间窗口（30-60分钟）内降低假阳性的概率。特别是某些长度合适的抑制剂，在几乎不牺牲敏感性的情况下实现了这一点。抑制剂-LAMP方法是一种不同于现有通用添加剂或扩增子鉴别方法的靶向策略。它可以单独使用或与其他方法结合使用，以缓解NSA问题并提高LAMP检测的整体性能。

引言

自2000年[1]问世以来，环介导等温扩增（LAMP）迅速成为核酸扩增检测（NAAT）的研究焦点。其便捷和快速的特点与世界卫生组织提出的“ASSURED”框架（经济实惠、灵敏度高、特异性强、用户友好、快速/稳健、无需设备、易于操作）高度契合，适用于即时检测（POCT）的发展[2]。然而，LAMP中非特异性扩增（NSA）的频繁发生使其成为一种容易产生假阳性的检测方法[3]、[4]、[5]。最近，一种经FDA批准的用于巨细胞病毒检测的LAMP方法在两家临床机构应用时显示出比最初报告更高的假阳性率[6]。自扩增引物二聚体和发夹结构是实时LAMP中信号噪声增加和阳性时间延迟（TTP）的主要原因[7]。Rolando等人[8]提出了一种解释NSA起源的模型，认为内引物的同源或异源二聚体在Bst DNA聚合酶的作用下形成类似LAMP扩增机制的自扩增“哑铃”结构。尽管这种结构在热力学上不稳定且罕见，但一旦形成，就会成为指数级NSA的稳定起点。这些限制凸显了迫切需要解决NSA问题，以便更广泛地应用LAMP。

迄今为止，关于LAMP中NSA起源和发展的详细机制很少有报道。因此，迄今为止尝试的方法几乎未能解决NSA的根本原因。这些方法大致可分为两类：第一类采用仅检测特异性扩增子的策略，旨在使用探针[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、CRISPR/Cas[14]、[15]、[16]等方法从混合物中分离出目标扩增产物；第二类则使用据称能提高LAMP特异性的添加剂，例如普鲁兰[17]、[18]、氧化石墨烯-金纳米颗粒复合材料[19]和四甲基氯化铵[20]。前者只是规避而非解决NSA的根本原因，同时允许其发生，不可避免地增加了最终产物鉴别的复杂性和成本。在某些情况下，当特异性扩增被NSA取代时，这种方法甚至可能降低灵敏度，尤其是在模板浓度接近检测限时。关于添加剂方法，由于对它们在LAMP中优化效果的作用机制了解不足，需要进一步研究以验证它们是否能在各种LAMP检测中持续提高性能。明确LAMP中NSA产生的关键因素无疑是开发针对这一问题的靶向方法的前提。

在本研究中，我们探讨了NSA的形成与LAMP内引物之间的关系，并建立了一种抑制剂-LAMP策略并评估了其性能，显示出其在未来诊断应用中的巨大潜力。优化后的解决方案保留了LAMP的固有特性，同时在阳性产物和非特异性扩增产物之间保持了足够的时间分离，尤其是在模板浓度较低的情况下。

部分内容摘要

模板DNA制备

本研究得到了广东省妇女儿童医院伦理委员会的批准。临床儿科尿液样本的收集过程中严格保护了患者的临床信息隐私。

使用基于磁珠的商业试剂盒（DAAN GENE有限公司，广州，中国）从hCMV阳性或hCMV阴性的儿科尿液样本中提取并纯化了DNA。该试剂盒与Smart32?半自动仪器配合使用。

引物引起的NSA在LAMP中很常见

首先，使用三种已发表的引物组分别针对人类巨细胞病毒（hCMV）DNA聚合酶催化亚基（UL54）[21]、包膜糖蛋白B基因（UL55）[23]和包膜糖蛋白H基因（UL75）[22]进行了无模板实时LAMP检测（图S2A–C）。尽管TTP和信号强度有所不同，但在所有三个引物组的八个重复实验中，100%的反应都出现了NSA。接下来，又使用了另外三种引物组进行检测

结论

总之，引物引起的NSA是LAMP检测中的常见问题。启动内引物（IIP）在NSA的形成中起着关键作用，IIP二聚体通常具有较低的ΔG值。在开发阶段，结合ΔG指导的内引物设计和双引物SCAN方法为选择高特异性引物组和识别IIP提供了有效的工作流程。添加一个或两个IIP抑制剂可以显著抑制NSA。特别是-3和-6抑制剂能有效缓解甚至消除NSA

作者贡献声明

莫一迪：撰写初稿、数据可视化、方法设计。朱娟：实验设计、数据分析。苏志坚：撰写、审稿与编辑、结果验证、资源协调。张长斌：项目监督、资金筹集。黄彦琳：软件开发、数据管理。胡静静：概念构思

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了广东省医学研究基金会（A2024303, A2018212）和广东省妇女儿童医院临床研究基金会（20250078）的支持。