一种基于电催化双重分子印迹聚合物的生物传感器能够在无需抗体的情况下实现对CD44的飞摩尔级检测

《Analytica Chimica Acta》：An Electrocatalytic Dual Molecularly Imprinted Polymer-Based Biosensor Enables Femtomolar Detection of CD44 without Antibodies

抗体免费双分子印迹聚合物（MIPs）平台实现CD44超灵敏检测（0.31 pg/mL），利用Cu2+配位定向合成检测探针，结合3D打印电极电聚合捕获探针，降低非特异性结合，提升特异性至<3%交叉反应，在唾液和血清中验证稳定性（90.5%信号保留13天）和回收率（96.8-100.1%）。

　　

Ping Xia|Cheng Chen|Ruifang Bai|Weige Dong|Yuchun Fu|Chungu Zhang|Lianhai Shan|Shun Feng

中国西南交通大学生命科学与工程学院仿生合成天然药物工程研究中心，成都610031

摘要

夹心型电化学免疫传感器的开发受到匹配良好的抗体对有限可用性和高成本的严重限制。为了解决这个问题，我们提出了一种无需抗体的生物传感平台，用于超灵敏地检测癌症生物标志物CD44，该平台利用了一对分子印迹聚合物（MIPs）。通过金属亲和导向的表面印迹技术，在磁性纳米颗粒上合成了一个具有亚4纳米印迹层的检测探针（P-MIP），利用Cu²⁺-组氨酸配位实现定向模板固定。然后，在微型3D打印电极上，通过原位电聚合纳米级多巴胺层在P-MIP预先捕获的CD44周围形成互补的捕获探针（E-MIP）。这种双方向印迹策略有效地减少了非特异性结合，并提高了目标特异性。重要的是，嵌入的Cu²⁺中心既作为结构锚点，又作为内在的氧化还原报告剂，实现了无标记检测并增强了导电性。通过集成3D打印微电池，该传感器仅使用10 μL样本即可达到0.31 pg·mL^-1（13.4 fM）的卓越检测限和0.5 pg·mL^-1–50 ng·mL^-1的宽线性范围。它在添加了人类唾液和小鼠血清的样本中表现出显著的选择性（<3%交叉反应性）、高重复性（RSD = 1.9%）、优异的稳定性（13天内信号保留率90.5%）和满意的回收率（96.8–100.1%）。这项工作为精确检测蛋白质生物标志物建立了一个多功能且稳健的分析平台，对实际诊断应用具有重大前景。

引言

蛋白质生物标志物的灵敏和特异性检测在临床诊断中至关重要，可以实现疾病的早期检测、治疗监测和预后评估[1]，[2]。在各种蛋白质生物标志物中，CD44是一种参与细胞粘附、迁移和信号传导的跨膜糖蛋白，在许多癌症中过度表达，是肿瘤进展和转移的宝贵指标[3]。在血清和唾液等易于获取的生物流体中检测CD44为非侵入性癌症诊断提供了有希望的途径。

目前蛋白质检测的金标准是酶联免疫吸附测定（ELISA），它具有较高的特异性，但受到繁琐程序、大量样本消耗和有限灵敏度的限制[4]，[5]。虽然夹心型电化学免疫传感器提供了一种具有增强灵敏度和微型化潜力的替代方案，但其性能严重依赖于能够结合目标蛋白不同表位的匹配良好、高亲和力的抗体对[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[12]。由于单克隆抗体的生产耗时且成本高昂、批次间差异以及针对表位有限的蛋白质的固有难度，获取这样的抗体对仍然是一个重大瓶颈[13]。尽管已经探索了诸如适配体[14]，[15]和纳米抗体[16]，[17]等替代方法，但它们通常涉及复杂的选择过程或存在稳定性问题。

分子印迹聚合物（MIPs）作为一种有吸引力的合成受体，可以克服这些限制，提供更好的稳定性、更低的成本和更简单的制备过程[18]，[19]。然而，传统的蛋白质印迹策略经常导致结合位点不均匀、模板去除不完全以及识别腔体深埋，这些因素共同影响了结合动力学和特异性[20]。在为夹心型检测创建互补的MIP对时，这些挑战尤为突出，尤其是对于像CD44这样的复杂蛋白质目标来说，这一领域几乎未被探索。

同时，纳米材料已被用于增强电化学生物传感器[21]，[22]，[23]。磁性纳米颗粒（NPs）有助于目标物的预浓缩和分离[24]，[25]，而共价有机框架（COFs）则提供了较大的表面积和可调的功能性，用于固定识别元件[26]，[27]。我们假设将这些纳米材料与新的印迹策略结合，可以构建完全合成的基于MIP的夹心检测方法。

在这里，我们通过实施分层双MIP夹心架构，提出了一种无抗体的生物传感平台，用于超灵敏地检测CD44。我们的策略采用金属亲和导向的表面印迹技术（MAO-SIT）来制备一对合成抗体模拟物。通过可控的溶胶-凝胶过程，在磁性纳米颗粒上合成了一个具有超薄（<4 nm）印迹层的检测探针（P-MIP），通过其c端6×his标签与螯合的Cu²⁺离子的配位实现定向固定CD44。随后，在微型3D打印电极上，通过原位电聚合纳米级多巴胺（PDA）层在P-MIP预先捕获的CD44周围形成互补的捕获探针（E-MIP）。这种双方向印迹策略有效地减少了非特异性结合，并确保了高表位可及性。重要的是，嵌入的Cu²⁺中心同时具有结构锚点和内在氧化还原报告剂的功能，消除了对外源标记的需求并增强了导电性。这项工作为精确检测蛋白质生物标志物建立了一条多功能且稳健的途径，克服了对生物抗体的关键依赖性。工作流程示意图见图1。

部分摘录

试剂和设备

化学品和仪器在支持信息中有所介绍。

3D打印电化学电池的制造

使用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术制造了一个微型电化学电池（565 μL）。电池主体使用绝缘聚乳酸（PLA）丝材打印，而集成的工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE）则使用导电碳黑/PLA（CB/PLA）复合丝材打印。

P-MIP检测探针的合成和表征

作为检测探针的核心壳P-MIP纳米颗粒通过MAO-SIT成功合成。该方法利用重组CD44的C端6×His标签与EDTA-Fe₃O₄纳米颗粒上螯合的Cu²⁺离子之间的配位，确保了均匀和定向的模板固定，这是生成均匀结合位点的关键前提。

通过多模态表征确认了P-MIP的分层结构和组成。TEM图像（图2a，b）显示

结论

总之，我们通过实施分层双MIP夹心架构，建立了一种稳健且无抗体的蛋白质生物标志物超灵敏检测方法。这一策略直接克服了传统免疫传感中获取匹配良好抗体对的关键挑战。通过MAO-SIT方法，精确工程化了一对合成抗体模拟物，包括P-MIP检测探针和E-MIP捕获探针，用于CD44的检测。

CRediT作者贡献声明

Ping Xia：撰写 – 原始草稿、研究、正式分析、数据管理、概念化。Shun Feng：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取。Chungu Zhang：正式分析。Lianhai Shan：撰写 – 审稿与编辑、监督。Weige Dong：可视化、研究。Yuchun Fu：方法学。Cheng Chen：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、研究、正式分析、数据管理、概念化。Ruifang Bai：可视化、研究

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号22174117）的支持。