低成本光生物反应器：实现气体囊泡规模化生产的新策略

《IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control》：A Low-Cost Photobioreactor for Scalable Gas Vesicle Production

为解决气体囊泡（GVs）生产依赖昂贵CO2摇床、成本高且难以规模化的问题，研究人员开发了一种基于气泡柱光生物反应器的低成本生产方案。该方案将设备成本降至现有方法的10%，且所产GVs在静水压塌陷压力、流体动力学直径及超声成像对比度等方面与传统方法无显著差异，为GV作为超声造影剂和生物传感器的广泛应用扫清了成本障碍。

　　

在生物医学成像领域，超声技术因其无创、实时、成本低廉等优势而备受青睐。然而，传统的超声造影剂——微泡，因其微米级的尺寸和合成性质，通常被限制在血管内，难以对血管外的细胞活动进行成像。为了突破这一局限，科学家们将目光投向了气体囊泡（Gas Vesicles, GVs）。GVs是一种由细菌产生的天然蛋白质纳米结构，内部充满空气，能够散射声波，被誉为超声领域的“绿色荧光蛋白”。它们不仅尺寸更小，能够穿过血管壁，还能通过基因工程进行改造，实现细胞特异性标记和生物传感功能。

尽管GVs前景广阔，但其研究和应用却面临着一个巨大的障碍：高昂的生产成本。目前，生产GVs的标准方法依赖于在昂贵的CO₂摇床培养箱中培养蓝藻Dolichospermum flos-aquae。这种设备不仅价格高昂（约2.4万欧元），而且体积庞大，极大地限制了其在普通研究实验室的普及和规模化生产。因此，开发一种低成本、易获取且可扩展的GVs生产方法，对于推动这一革命性技术的广泛应用至关重要。

为了打破这一瓶颈，来自代尔夫特理工大学的研究团队在《IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control》上发表了一项突破性研究。他们设计并构建了一种基于气泡柱反应器原理的低成本光生物反应器，成功地将GVs的生产成本降至现有方法的10%左右。更重要的是，他们通过一系列严格的表征实验证明，利用这种新方法生产的GVs，其物理化学性质与标准方法生产的GVs完全一致，确保了两种方法产物的互换性。这项研究为GVs的普及应用铺平了道路，有望加速其在生物医学研究和临床诊断中的发展。

关键技术方法

为了构建低成本、可扩展的GVs生产平台，研究人员主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   光生物反应器设计与构建：研究团队设计了一种基于气泡柱反应器原理的模块化光生物反应器。该系统集成了电子控制系统（用于调控LED光源和CO₂浓度）、气动系统（用于提供空气和CO₂）以及反应器系统（用于无菌培养）。该设计利用现成的标准实验室组件，显著降低了设备成本，并实现了对培养条件的精确控制。
2. 2.
   微生物培养与收获：研究使用Dolichospermum flos-aquae（CCAP 1403/13F菌株）作为GV的生产菌株。通过逐级放大培养，在光生物反应器中维持特定的培养条件（25±3°C，1% CO₂，5500 lux光照）。利用GVs的浮力特性，通过低温静置过夜，使产气囊泡的细胞上浮，从而实现了高效、温和的细胞收获。
3. 3.
   气体囊泡的纯化与修饰：收获的细胞通过温和的化学裂解（使用Solulyse?或高渗蔗糖溶液）释放GVs。随后，利用GVs的浮力特性，通过多次低速离心和浮选步骤进行纯化。此外，研究还通过尿素处理去除了GVs的强化蛋白GvpC，制备了用于非线性超声成像的ΔGvpC GVs。
4. 4.
   气体囊泡的表征与成像：为了验证新方法产物的质量，研究团队对GVs进行了全面的表征。这包括：通过静水压塌陷压力测量评估其机械强度；通过可调电阻脉冲传感（TRPS）技术测量其流体动力学直径；通过建立标准曲线将光密度（A₅₀₀）与GV浓度关联，实现简便的定量；以及通过超声成像（包括xBmode和xAM模式）评估其作为造影剂的性能。

研究结果

1. 光生物反应器系统成功构建并实现低成本运行

研究团队成功构建了一个模块化的光生物反应器系统，该系统由电子、气动和反应器三个子系统组成。成本分析显示，该系统的初始设备投资仅为427欧元，而传统的CO₂摇床培养箱成本高达24,400欧元，新方法将设备成本降低了约98%。此外，新系统的物理占地面积更小，且能够通过并联多个反应瓶实现规模化生产，而无需增加额外的核心控制设备。

2. 新方法在GV产量上表现出优势

尽管在光生物反应器中培养的D. flos-aquae细胞倍增时间（2.16天）略长于摇床培养箱方法（1.72天），但到第14天收获时，光生物反应器方法生产的GV浓度比摇床培养箱方法高出84%。这表明新方法在单位体积培养物中生产GV的效率更高。

3. 新方法生产的GVs在物理化学性质上与传统方法无差异

为了确保两种方法生产的GVs可以互换使用，研究人员对它们进行了全面的表征。结果显示，无论是完整的GVs还是ΔGvpC GVs，两种生产方法在以下关键参数上均无统计学差异：

• •
  静水压塌陷压力：两种方法生产的GVs的塌陷压力中点（CP_1/2）没有显著差异（p > 0.05），表明它们具有相同的机械强度。
• •
  流体动力学直径：通过TRPS测量，两种方法生产的GVs的粒径分布相似，中位直径均在136-137纳米之间。
• •
  超声成像对比度：将GVs包埋在琼脂糖体模中进行超声成像，两种方法生产的GVs在xBmode和xAM模式下的对比噪声比（CNR）没有显著差异（p > 0.15），证明它们作为超声造影剂的性能完全一致。

结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种用于气体囊泡（GVs）规模化生产的低成本光生物反应器方案。该方案通过采用模块化设计和现成组件，将设备成本降至传统CO₂摇床培养箱的10%以下，极大地降低了GV研究的准入门槛。

研究的关键结论是，利用这种新方法生产的GVs，在关键的物理化学性质（如机械强度、尺寸分布）和功能（如超声成像对比度）上，与标准方法生产的GVs没有显著差异。这一发现确保了两种方法产物的完全互换性，意味着使用新方法生产的GVs可以直接应用于所有基于GV的现有研究和技术中。

在讨论中，作者指出，尽管新方法中细胞的倍增时间稍长，但其最终GV产量更高。作者推测这可能与培养深度有关：摇床培养箱中的浅层培养可能导致光强过高，促进碳水化合物积累，从而增加了细胞内的膨胀压，导致部分GVs在细胞内塌陷。而光生物反应器中的深层培养可能避免了这一问题，从而实现了更高的GV产量。

该研究的一个主要局限性是依赖环境温度控制，这可能会限制其在没有恒温控制的实验室中的复制。然而，作者指出，可以通过将反应器置于标准恒温水浴中来克服这一限制。此外，该方案的成功实施依赖于一种商业裂解试剂（Solulyse?），但作者也指出，可以使用高渗蔗糖溶液作为替代方案。

总而言之，这项研究为GV的生产提供了一种经济、可扩展且高效的替代方案。通过显著降低成本和空间要求，同时保证产品质量，该方案有望促进GV作为超声造影剂和生物传感器在生物医学研究和临床诊断中的广泛应用，加速这一前沿技术的发展。