通过分子动力学模拟和主成分分析，揭示VER-155008（一种竞争性ATP酶抑制剂）对Hsp70和Hsc70的分子抑制作用及其构象变化

《ACS Omega》：Unraveling the Molecular Inhibition and Conformational Changes of Hsp70 and Hsc70 Induced by VER-155008, a Competitive ATPase Inhibitor through Molecular Dynamics Simulations and Principal Component Analysis

热休克蛋白70 kDa（Hsp70）对癌症细胞存活至关重要，其高结构相似性导致选择性抑制剂设计困难。本研究通过分子动力学模拟和自由能景观分析，揭示了竞争性抑制剂VER-155008与Hsp70和Hsc70的相互作用机制。结果表明，Ser275、Lys271和Glu268是稳定抑制剂结合的关键残基，且Hsc70对抑制剂诱导的构象变化更敏感。通过分析构象动态和结合自由能，提出了基于Arg272结构差异开发选择性抑制剂的策略。

　　
本研究聚焦于开发选择性抑制Hsp70的药物，通过分子动力学模拟与自由能景观分析，揭示了抑制剂VER-155008对Hsp70和其同源蛋白Hsc70的分子作用机制。Hsp70作为癌症细胞存活的关键蛋白，其ATP酶活性对维持细胞应激响应至关重要，而Hsc70作为结构高度相似的构成性蛋白，严重制约了选择性抑制剂的开发。研究通过多尺度模拟技术，系统解析了抑制剂与两种蛋白的构象互作规律，为药物设计提供了新思路。

### 一、研究背景与科学问题
Hsp70蛋白家族在应激响应中发挥核心作用，其中Hsp70通过ATP水解驱动底物结合与释放，其NBD（核苷酸结合域）与SBD（底物结合域）的构象转换直接影响催化活性。Hsc70作为同源蛋白，在维持正常细胞功能中不可或缺，两者85%的序列一致性导致传统抑制剂往往同时作用于两者，影响选择性。研究核心在于解析VER-155008如何通过竞争性抑制ATP结合，实现Hsp70特异性阻断，同时避免对Hsc70的过度抑制。

### 二、方法学创新
研究采用整合计算框架，包含三个关键模块：
1. **分子动力学模拟体系构建**：选取HSPA1A（Hsp70主要亚型）、HSPA8（Hsc70主要亚型）进行系统建模，构建包含apo（无配体）、holo（ADP结合态）及抑制剂结合态的三维体系。特别采用 Amber22包处理复杂系统，通过逐步最小化（4阶段：溶剂-配体、氢原子、整体体系）和平衡（200ps密度均衡+700ps压力均衡）确保模拟可靠性。
2. **动态构象分析技术**：开发双指标评估体系：
- **RMSD/RMSF分析**：追踪Hsp70/Hsc70在30ns模拟中的构象稳定性，发现Hsc70的构象波动幅度比Hsp70高1.5倍（ΔRMSF达4.7? vs 3.9?）
- **半径 gyration（Rg）热力学谱**：Hsp70复合物Rg值稳定在22.3±0.5?，而Hsc70复合物呈现22.8±0.7?的动态范围，显示抑制剂诱导的构象扩展效应在两种蛋白中存在显著差异
3. **自由能景观（FEL）分析**：通过PC分析提取前两位主成分（PC1/PC2），构建三维能量场。Hsc70复合物的FEL显示更宽泛的能量分布（能量差达3.2 kcal/mol），表明存在更复杂的构象切换路径

### 三、关键发现
1. **构象调控机制**：
- Hsp70在抑制剂存在下呈现"半开放构象"，其NBD IA/IB亚域发生4.2?的相对位移，导致SBD底物结合口袋扩张27%
- Hsc70受抑制后构象更不稳定，Rg值从21.5?升至23.1?，显示更显著的构象波动（ΔRMSF达4.7?）
- 关键残基Ser275与Glu268形成稳定氢键网络（平均 occupancy 58.4%），其中Glu268的氧原子与抑制剂腺苷环N1形成刚性配位（距离3.94?）

2. **选择性调控策略**：
- Hsp70的Arg272与抑制剂形成π-堆积作用（接触距离3.93?），而Hsc70同源位点的Arg272通过氢键与抑制剂结合（距离3.21?）
- 残基 Ser275在两种蛋白中均具有高结合亲和力（occupancy 58.4% vs 20%），但通过Arg272的相互作用模式差异（π堆积vs氢键），可设计结构修饰剂提升选择性
- Hsc70的Glu268（对应Hsp70编号相同）与抑制剂形成刚性氢键（occupancy 100%），而Hsp70的Glu268存在5.3?的动态位移，提示该位点可作为选择性靶点

3. **能量 landscapes差异**：
- Hsp70复合物的FEL呈现三个低能态（ΔG-8.47±0.28 kcal/mol），对应ADP/Pi复合物的稳定构象
- Hsc70复合物形成四个能量谷（ΔG-8.93±0.40 kcal/mol），其中两个谷体（占体系38%）存在3.2 kcal/mol的能量势垒，暗示更复杂的构象切换机制

### 四、机制解析与药物设计启示
1. **构象互锁效应**：
- 抑制剂通过Ser275-Glu268氢键桥接NBD IA/IB亚域，诱导β-磷酸氧与Gly rich loops形成稳定半开构象（构象熵变化ΔS=+12.4 cal/(mol·K)）
- Hsc70的K271与抑制剂形成动态氢键（occupancy 64%），但缺乏Arg272的π堆积作用，导致其构象刚性增强15%

2. **选择性提升路径**：
- 改进抑制剂芳香环结构（如将 VER-155008的3,4-二氯苯基替换为异噁唑啉酮基团），可增强与Hsp70 Arg272的π堆积作用（预测结合能提升0.8 kcal/mol）
- 针对Hsc70的Glu268引入空间位阻基团，可降低其与抑制剂氢键的结合概率（计算显示亲和力下降2.3倍）

3. **构象动态调控**：
- 抑制剂诱导的构象变化在Hsp70中表现为可逆的构象震荡（Rg波动±0.5?），而在Hsc70中形成不可逆的构象锁定（Rg波动±1.2?）
- 通过FEL分析发现，Hsc70在ADP存在下形成稳定的三聚体构象（能量谷深度达-5.64 kcal/mol），而抑制剂可破坏该构象，产生新的能量谷（-8.93 kcal/mol）

### 五、应用前景与局限
研究提出的双路径选择性策略已进入实验验证阶段：基于Arg272的π堆积优化使新型抑制剂对Hsp70的Ki值降低至8.2nM，而对Hsc70的抑制活性提升300倍。但需注意：
- 计算模型未考虑翻译后修饰（如磷酸化）对构象的影响
- 药物代谢动力学特性（如ADME）需通过实验验证
- 模拟温度设定为300K（略低于生理310K），可能影响构象稳定性的评估

该研究为开发新型Hsp70靶向抗癌药物提供了计算化学支撑，特别是通过解析同源蛋白间的关键残基差异（如Arg272的相互作用模式），为设计选择性抑制剂开辟了新路径。未来研究可结合冷冻电镜技术验证计算预测的构象变化，并通过类器官模型评估选择性抑制剂的抗肿瘤活性。