来自人类分离株双歧杆菌 breve DSM 20213 的 GH42 β-半乳糖苷酶：其生化和转半乳糖基化特性揭示了其在半乳寡糖合成方面的潜力

《ACS Omega》：A GH42 β-Galactosidase from the Human Isolate Bifidobacterium breve DSM 20213: Biochemical and Transgalactosylation Properties Reveal the Potential for Galacto-oligosaccharides Synthesis

β-半乳糖苷酶Bbreβgal-III从婴儿肠道优势菌B. breve DSM 20213中分离纯化，属GH42家族同源三聚体，分子量240 kDa。其催化特性显示pH 5.0活性最佳，热稳定性达55°C，对β-1→3/6-糖苷键底物及GOS合成具有特异性，在低pH条件下优先催化乳糖生成6-和3-半乳糖基乳糖，产率达17%。该酶与GH2家族酶在底物偏好和活性位点构象上存在显著差异，为工程改造提升GOS合成效率提供了新靶点。

　　
β-半乳糖苷酶的分子特性及其在Galacto-oligosaccharides（GOS）合成中的应用研究

β-半乳糖苷酶作为糖苷水解酶的重要成员，在乳制品加工和功能性食品开发中具有关键作用。近年来，研究者发现毕赤酵母等微生物中表达的β-半乳糖苷酶能够通过转半乳糖苷酶活性将乳糖转化为多种低聚糖产物。然而，这类酶的结构差异显著影响了其功能特性，特别是转糖苷活性的强弱。本研究重点解析了短链拟杆菌（Bifidobacterium breve）DSM 20213菌株中第三个β-半乳糖苷酶（Bbreβgal-III）的分子特性、催化动力学及产物形成规律，为功能性低聚糖的定向合成提供了新依据。

### 一、酶的结构与分子特性
Bbreβgal-III属于糖苷水解酶家族42（GH42），其三维结构通过AlphaFold预测与已知结构（PDB:4UCF）高度相似。该酶以三聚体形式存在（总分子量240 kDa，单体77 kDa），每个亚基包含典型的GH42酶活性中心特征。结构分析显示，催化关键位点位于相邻亚基间的通道，Glu160和Glu318分别承担酸/碱催化和亲核攻击功能。这种深埋式活性位点与GH2酶的浅表结构形成鲜明对比，解释了为何GH42酶更易形成非水解性中间体，从而具备转糖苷活性。

### 二、催化动力学特性
1. **底物特异性**：Bbreβgal-III对硝基苯基-β-半乳opyranoside（oNPG）的催化效率（kcat/Km）是乳糖的约700倍，显示对去氧糖基底物的强烈偏好。通过对比不同糖苷键底物的转化率，发现该酶对β1→3、β1→4和β1→6连接的半乳糖苷具有显著选择性，尤其对6位连接的底物（如β1→6-半乳糖基乳糖）展现出高效催化。

2. **抑制动力学**：oNPG表现出明显的底物抑制效应（Ki,S≈13.8 mM），而乳糖在此浓度下无显著抑制。这种选择性抑制现象揭示了酶活性中心对底物构象的精准识别机制。

3. **热力学稳定性**：该酶在pH 4.5-6.5范围内保持稳定，其中pH 5.0时活性最高且最稳定。温度耐受性测试显示，在45-55℃范围内，存在Mg2?辅助时，酶半衰期延长至20小时以上。DSC分析进一步证实其热稳定性存在单相转变特征（Tm≈58℃）。

### 三、转糖苷活性与产物分析
1. **GOS合成动力学**：在37℃、初始乳糖浓度600 mM的条件下，Bbreβgal-III的转糖苷活性占总活性的22%（当乳糖转化率达40%时）。产物分析显示，6'-Galactosyllactose（占GOS总量的56%）和3'-Galactosyllactose（13%）为主要产物，这与酶的底物特异性高度吻合。

2. **产物降解机制**：不同于GH2酶（如Bbreβgal-I和βgal-II），Bbreβgal-III表现出对自产GOS的快速水解能力。当乳糖转化率达40%时，已有78%的酶活性用于底物水解而非转糖苷反应，导致最终GOS产量（17%总糖）显著低于GH2酶（33-38%）。

3. **高聚糖形成**：通过UPLC-MS分析发现，反应体系中存在DP3和DP4的GOS产物。NMR光谱解析表明，DP3产物主要为β1→6-β1→4-半乳糖基乳糖和β1→3-β1→4-半乳糖基乳糖，而DP4产物包含6,6'-双半乳糖基乳糖等复杂结构。

### 四、pH与温度活性特征
1. **pH依赖性**：在乳糖水解体系中，pH 5.0时活性达峰值（92%）。当pH<5.0时，活性下降显著，可能与关键残基的质子化状态改变有关。对比发现，GH2酶的活性峰值出现在中性pH范围（6.5-7.0），而GH42酶在酸性条件更具优势。

2. **温度适应性**：该酶在20-50℃范围内保持稳定，其中45℃时仍保留72%活性。值得注意的是，在含10 mM MgCl?的缓冲液中，55℃时的酶活性半衰期延长至20小时，表明金属离子对热稳定性的显著促进作用。

### 五、功能特性与生理意义
1. **肠道环境适配性**：研究发现B. breve DSM 20213菌株的βgal-III酶在pH 5.0-5.5的酸性环境中活性最佳，这与婴儿肠道内pH值（通常5.0-5.5）高度匹配。该特性使其在母乳低聚糖（HMOs）降解中具有天然优势。

2. **HMO分解机制**：通过结构比对发现，Bbreβgal-III与已知的HMO降解酶（如Bga42A）在活性位点的空间构型上具有一致性。特别是对β1→3连接的半乳糖苷结构（如LNT）的特异性水解能力，可能与其在活性位点-1和+1亚位的结合特性相关。

3. **功能协同性**：该菌株同时表达三种β-半乳糖苷酶（GH2双酶+GH42单酶），形成互补代谢网络：GH2酶优先处理乳糖和4位连接的低聚糖，而GH42酶专注于3/6位连接结构的转化。这种分工体系有效提升了复杂HMO的分解效率。

### 六、工程改造潜力
研究指出，通过定向进化技术对Glu160/Glu318残基进行改造，可显著增强转糖苷活性。例如，将BbgII（PDB:4UCF）的Glu161残基替换为His后，转糖苷活性提升3倍。此外，活性位点的通道结构优化（如增大底物入口尺寸）可能进一步改善大分子低聚糖的产率。

### 七、工业应用前景
基于该酶的特性，开发新型生物工艺的可能性包括：
1. **定向合成特定GOS**：通过固定化酶技术选择性催化6位连接反应，可获得高纯度6'-Galactosyllactose（市场价达$200/kg）
2. **复合酶系统设计**：将GH42酶与GH2酶组合使用，可同时实现乳糖水解（产葡萄糖/半乳糖）和GOS合成（产功能性低聚糖）
3. **发酵工艺优化**：利用该酶对pH 5.0的适应性，开发常温发酵工艺（40℃）可维持80%以上活性

### 八、研究局限与展望
当前研究存在以下局限：
1. 金属离子协同效应尚未完全解析
2. 大DP值GOS的合成机制尚不明确
3. 酶稳定性在长期储存（>6个月）中未验证

未来研究方向建议：
1. 构建多酶协同反应体系（如βgal-III+β1→6转糖苷酶）
2. 开发基于CRISPR的精准改造技术
3. 建立活性-稳定性数学模型指导工艺优化

该研究不仅揭示了GH42酶在GOS合成中的独特机制，更为功能性低聚糖的定向生产提供了理论依据。特别在婴幼儿食品添加剂领域，Bbreβgal-III可能成为替代进口HMO酶的重要资源。通过结构-功能关系解析，为理性设计高效转糖苷酶奠定了基础，预计可使GOS产率从现有17%提升至30%以上。