PARP1介导的ADP-核糖基化全局重塑抑制甲型流感病毒感染的新机制

《Nature Communications》：Global remodeling of ADP-ribosylation by PARP1 suppresses influenza A virus infection

本研究揭示了甲型流感病毒（IAV）感染触发PARP1介导的ADP-核糖基化（ADPr）全局重塑，从单ADP-核糖基化（MARylation）向多ADP-核糖基化（PARylation）转变，抑制病毒复制。通过ELTA-MS技术鉴定近4000个修饰位点，发现病毒蛋白NS1通过结合dsRNA拮抗此过程。该研究确立了ADPr为先天免疫样抗病毒应答，为抗病毒策略提供新靶点。

　　

当甲型流感病毒侵入人体细胞时，一场微观层面的军备竞赛悄然展开。病毒试图劫持宿主细胞的 machinery 进行自我复制，而细胞则激活多种防御机制予以反击。在这场攻防战中，蛋白质的转录后修饰成为双方角逐的关键战场。ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）作为一种高度动态可逆的修饰方式，由PARP酶家族执行，能够通过添加ADP-核糖单元来调控蛋白质功能、丰度、定位和周转。然而，这种修饰在病毒感染过程中的具体作用和调控机制尚不明确。

发表在《Nature Communications》的这项研究揭示了甲型流感病毒感染会引发全局性的ADP-核糖基化重塑，特别是由PARP1介导的多ADP-核糖基化（PARylation）显著上调，从而有效抑制病毒复制。研究人员发现，病毒蛋白NS1能够拮抗这一抗病毒机制，这为理解宿主-病毒相互作用提供了新的视角。

研究团队采用酶促标记末端ADPr结合质谱分析（ELTA-MS）技术，在感染过程中系统鉴定了ADP-核糖基化修饰组。此外，通过免疫印迹、免疫共沉淀、聚合酶活性测定等多种实验方法，结合PARP1基因敲除细胞模型和病毒NS1缺失突变体，深入解析了ADP-核糖基化在抗病毒应答中的功能和机制。

主要技术方法

研究使用人肺癌A549细胞、鸡UMNSAH/DF-1细胞、猪肾PK(15)细胞和蝙蝠肺Tb1Lu细胞进行病毒感染实验。通过ELTA-MS技术鉴定ADP-核糖基化位点，利用PARP抑制剂（如Olaparib、AG14361等）和PARG抑制剂PDD00017273调控修饰水平。构建PARP1敲除细胞系并通过Sleeping Beauty转座子系统进行基因回补。病毒复制通过噬斑实验定量，蛋白质相互作用通过免疫共沉淀验证。

流感病毒感染触发PARylation并修饰病毒蛋白

研究发现，甲型流感病毒感染可显著诱导全局性PARylation上调，而单ADP-核糖基化（MARylation）水平基本不变。这种应答在鸡、猪、蝙蝠等多种宿主细胞中均存在，且仅由具有复制能力的病毒触发，病毒RNA或天然免疫激活剂（如poly(I:C)）单独处理不足以诱导该反应。

免疫共沉淀实验证实病毒核蛋白（NP）和聚合酶复合物是ADP-核糖基化的直接靶标。羟胺处理可显著降低检测信号，表明病毒蛋白上存在酸性氨基酸残基的修饰。

感染期间ADP-核糖基化位点的全局鉴定包含病毒蛋白的功能性修饰

通过ELTA-MS技术，研究团队在感染状态下鉴定出近4000个ADP-核糖基化位点，涉及约1000种宿主蛋白和10种甲型流感病毒蛋白中的8种。NP是修饰位点最多的病毒蛋白，共发现27个修饰位点。

值得注意的是，感染并未显著改变修饰位点的数量，而是通过ELTA标记检测到PAR链长明显增加，表明感染主要改变了ADP-核糖基化的形式（从MAR向PAR转变）或特定位点的修饰频率。

甲型流感病毒NS1抑制PARylation

研究发现，不同毒株的NS1蛋白抑制PARylation的能力存在差异。PR8毒株的NS1比WSN毒株更能有效抑制PARylation。NS1缺失病毒（PR8ΔNS1）感染可导致PARylation急剧增加，且PARylation在感染早期即可检测到。

NS1的RNA结合活性对其抑制功能至关重要，NS1 R38A/K41A突变体（不能结合dsRNA）完全丧失了抑制PARylation的能力。

NS1抑制PARylation但不减少ADP-核糖基化位点数量

ELTA-MS分析显示，尽管NS1能显著抑制全局PARylation水平，但WT病毒和NS1突变病毒感染的细胞中，ADP-ribosylome的位点数量和修饰蛋白数量相当，大多数位点和蛋白在两种条件下均可检测到。这表明NS1并不改变修饰靶标，而是降低PARylation的频率或强度。

PARP1导向抗病毒PARylation

通过化学抑制剂和基因敲除实验，研究证实PARP1是感染诱导的PARylation的主要执行者。PARP1特异性抑制剂AG14361和Olaparib可显著抑制PARylation，而PARP5a/5b抑制剂XAV939无此效果。

在PARP1敲除细胞中，感染诱导的PARylation几乎完全消失。回补实验表明，具有PARylation活性的PARP1才能恢复抗病毒表型，而催化失活突变体（E988A）或仅保留MARylation活性的突变体（E988K）则不能。

PARP1介导的ADP-核糖基化抑制甲型流感病毒复制

病毒复制实验显示，PARP1敲除细胞中病毒滴度显著高于野生型细胞，在多周期和单周期复制实验中均观察到约5倍的增加。这表明PARP1介导的PARylation确实发挥了抑制病毒复制的功能。

研究结论与意义

本研究系统阐明了ADP-核糖基化在甲型流感病毒感染中的重要作用。PARP1介导的PARylation作为一种新型的先天免疫样应答，通过修饰病毒复制 machinery（特别是NP）抑制其功能。而病毒则通过NS1蛋白拮抗这一宿主防御机制。该研究不仅揭示了宿主-病毒相互作用的新层面，还为开发针对病毒免疫逃逸机制的治疗策略提供了潜在靶点。与已知编码宏结构域去ADP-核糖基化酶的RNA病毒不同，甲型流感病毒采用了独特的NS1依赖策略来对抗PARP介导的抗病毒反应，这为进一步研究病毒逃逸机制提供了新方向。