全基因组CRISPR筛选鉴定GRA38为弓形虫适应脂质丰富条件下脂质稳态的关键调节因子

《Nature Communications》：A genome-wide CRISPR screen identifies GRA38 as a key regulator of lipid homeostasis during Toxoplasma gondii adaptation to lipid-rich conditions

弓形虫等胞内寄生虫通过劫持宿主脂质维持生存，但其脂质感知与代谢适应机制不清。研究人员通过全基因组CRISPR筛选，发现分泌蛋白GRA38具有磷脂酸磷酸酶（PAP）活性，可调节脂质稳态。GRA38缺失导致磷脂酸积累、脂质组成改变及小鼠毒力减弱，揭示了寄生虫适应脂质环境的新机制，为抗寄生虫药物开发提供新靶点。

　　

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生虫，能够感染几乎所有温血动物的有核细胞，尤其在免疫缺陷个体和孕期感染时可引发严重的弓形虫病。这种寄生虫的成功寄生很大程度上依赖于其卓越的代谢灵活性，能够根据宿主环境的营养可用性调整自身代谢策略。脂质作为细胞膜构建、能量储存和信号传导的关键分子，对弓形虫的复制和生存至关重要。虽然已知弓形虫采用从头合成和宿主脂质清除的双重策略来满足其脂质需求，但寄生虫如何感知脂质可用性并介导代谢适应的分子机制仍然知之甚少。

以往的研究主要集中在营养丰富条件下的寄生虫生物学，而忽略了寄生虫在感染过程中会遇到的不同脂质环境。宿主细胞内的脂质含量差异巨大，从脂质丰富的巨噬细胞到脂质相对贫乏的某些组织环境。这种代谢灵活性对弓形虫的致病性至关重要，但调控这种适应的关键分子参与者尚未完全明确。理解弓形虫在不同脂质条件下维持脂质稳态的机制，不仅有助于揭示其致病机理，也可能为开发新的治疗策略提供靶点。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，由Mebratu A. Bitew领导的研究团队通过全基因组CRISPR筛选，旨在系统性鉴定在脂质丰富和脂质限制条件下对弓形虫适应性至关重要的基因。研究人员特别关注了一个名为GRA38的致密颗粒蛋白，并深入研究了其在弓形虫脂质稳态调节和致病性中的功能。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。他们首先通过脂质组学分析（LC-MS）表征了不同血清浓度下宿主细胞的脂质谱差异。接着利用全基因组CRISPR筛选技术比较了弓形虫在1%和10%胎牛血清（FBS）条件下的适应性差异。通过生长竞争实验、位点定向突变、蛋白质纯化与酶活性测定、免疫荧光定位、脂质摄取分析以及小鼠感染模型等多种方法，系统验证了GRA38的功能。研究队列包括体外培养的人包皮成纤维细胞（HFFs）和CD-1小鼠感染模型。

宿主脂质组学分析揭示1%和10% FBS条件下的显著差异

为了建立脂质丰富和脂质限制条件的基线差异，研究人员首先对在1%或10% FBS培养基中培养的未感染人包皮成纤维细胞（HFFs）进行了脂质组学分析。液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定出856种脂质种类，其中111种在两种条件间显示出统计学显著差异。主成分分析（PCA）和无监督聚类显示1%和10% FBS样本间明显分离，表明血清浓度对宿主脂质组成的显著影响。

在高血清条件下，多不饱和磷脂、固醇酯和甘油三酯积累增加，而在脂质限制培养中饱和和单不饱和长链磷脂水平较高。这些结果证实了宿主细胞脂质谱在1%和10% FBS条件间的显著差异，验证了此系统可用于通过CRISPR筛选研究弓形虫在不同脂质环境下适应性相关的基因。

全基因组CRISPR筛选鉴定不同血清浓度下决定弓形虫适应性的基因

为了鉴定弓形虫代谢适应性相关的基因，研究人员在脂质丰富（10%血清）和脂质限制（1%血清）条件下进行了全基因组CRISPR筛选。将稳定整合了 pooled guide RNA 文库的寄生虫群体在每种条件下的HFFs中培养并连续传代，通过下一代测序定量guide RNA丰度来评估条件特异性适应性缺陷。

筛选结果显示，寄生虫适应性对宿主细胞脂质可用性敏感，多个基因在脂质丰富与脂质限制条件下显示条件特异性重要性。在脂质限制条件下，内源性脂质处理、RNA加工和应激反应相关基因显示适应性缺陷。而在脂质丰富条件下，脂肪酸延伸、从头脂质合成、脂质运输和信号传导相关基因成为重要因子。GRA38在脂质丰富条件下显示最强的适应性缺陷，表明其功能与脂质丰度密切相关。

生长竞争实验验证选定敲除株在脂质丰富和限制条件下的差异性适应性

为验证全基因组CRISPR筛选结果，研究人员对选定的敲除株在脂质丰富（10% FBS）和脂质限制（1% FBS）条件下进行了生长竞争实验。将等量的野生型（WT）和敲除寄生虫混合，在HFFs中传代，并通过斑块分析评估适应性。

几个敲除株，包括Δ261400、Δgra57、Δgra70、Δgra71、Δ200370和Δ264740，在脂质限制条件下（1% FBS）显示特异性适应性缺陷，而在脂质丰富环境中保持野生型样适应性。相反，Δ269620和Δgra38在脂质丰富条件下显示适应性缺陷。Δgra38在10% FBS中缺陷最强，而在1% FBS中影响很小，表明其适应性与脂质丰度特异性相关。这些结果验证了CRISPR筛选结果，并突出了鉴定基因在寄生虫适应脂质可用性中的作用。

结构预测表明GRA38是卤酸脱卤酶（HAD）超家族中的酶

为确定GRA38在寄生虫中的定位，研究人员在内源性GRA38基因座引入了C末端MYC标签。在细胞内寄生虫中，GRA38与GRA7共定位于寄生泡（PV）腔。在细胞外寄生虫中，GRA38与GRA7在致密颗粒内共定位。

序列比对和结构分析显示，GRA38在顶复门寄生虫中高度保守，含有一个进化保守的催化基序DxDxT/V，为卤酸脱卤酶（HAD）的特征。结构建模显示GRA38与含有磷脂酸磷酸酶催化结构域的肌动蛋白斑块蛋白（APP1）具有结构相似性。分子对接显示磷脂酸（PA）与GRA38的疏水口袋有强结合亲和力，直接与DxDxT/V催化基序相互作用，而胆固醇作为非底物脂质则无特异性相互作用。

DxDxT/V基序为脂质丰富条件下GRA38催化功能所必需

为研究DxDxT/V基序在GRA38功能中的作用，研究人员将DxDxT/V基序突变为AxAxT/V（D72/74A），并用编码野生型或GRA38^D72/74A版本的质粒补充寄生虫。

在含1% FBS的培养基中，Δgra38寄生虫与野生型寄生虫相比显示正常复制。然而，在含10% FBS的培养基中培养时，Δgra38寄生虫显示含八个寄生虫的液泡显著减少和含一个寄生虫的液泡百分比更高。用野生型GRA38拷贝补充Δgra38寄生虫可挽救此表型，而用GRA38^D72/74A补充则不能，突出了DxDxT/V基序对寄生虫在高脂环境中生长的重要性。

斑块实验进一步证实了DxDxT/V基序在GRA38支持寄生虫在脂质丰富环境中复制和生存的作用。Δgra38寄生虫在1%或10% FBS中的入侵与野生型寄生虫无显著差异。

GRA38缺失导致宿主细胞死亡与脂质丰富环境中早期寄生虫逸出一致

研究人员观察到在含1%与10% FBS培养基中生长的菌株间每个液泡的寄生虫数量差异，提出Δgra38和GRA38^D72/74A菌株可能经历早期逸出。通过测量宿主细胞质乳酸脱氢酶（LDH）释放评估宿主细胞死亡，发现在10% FBS中感染的HFFs中，Δgra38和GRA38^D72/74A菌株的细胞死亡显著增加，与寄生虫逸出一致。寄生虫PKG抑制剂Compound 1处理显著降低LDH释放，确认升高信号来自主动逸出而非非特异性宿主细胞裂解。

GRA38调节弓形虫脂质积累和磷脂酸稳态

为研究GRA38在脂质动员和稳态中的作用，研究人员用不同寄生虫菌株感染宿主细胞，并使用BODIPY 493/503溶液比较寄生虫脂滴（LD）数量。Δgra38寄生虫与野生型或GRA38^WT寄生虫相比，在1% FBS和10% FBS中LD积累增加135%和139%。GRA38^D72/74A菌株在1和10% FBS中比野生型或GRA38^WT寄生虫积累多220%和182%的脂滴。这些结果表明GRA38缺失破坏LD含量，可能影响中性脂质积累，如DAG、TG。

为确定GRA38是否在PA代谢中起作用，HFFs用不同弓形虫菌株感染24小时，然后与硝基苯并恶二唑（NBD）缀合PA进一步孵育六小时。荧光成像显示，Δgra38敲除寄生虫与野生型和补充菌株相比有显著更高的NBD-PA水平。GRA38^D72/74A敲除寄生虫也有PA水平增加，表明GRA38中的DxDxT/V基序对其将PA转化为DAG的催化作用很重要。

GRA38破坏改变弓形虫磷脂酸代谢和脂质谱

为评估GRA38破坏如何影响弓形虫脂质代谢，研究人员对在HFFs中10% FBS培养的Δgra38、WT和补充（GRA38^WT）菌株进行脂质组学分析。共鉴定734种脂质种类，PCA和层次聚类确认菌株间明显且可重复的脂质组学变化。

Δgra38寄生虫与WT和GRA38^WT菌株相比显示总脂质丰度增加，与脂质稳态破坏一致。几种PA种类，包括PA 16:0_16:1、PA 16:0_18:1和PA 18:1_18:1，在Δgra38寄生虫中显著增加，而GRA38^WT菌株中PA水平恢复至WT水平，确认补充。

DAG种类，PAP活性的预期产物，显示更复杂模式。例如，DAG 16:0_16:0在Δgra38寄生虫中减少，与PA-to-DAG转化受损一致。然而，其他DAG如DG 16:0_18:2、DG 16:0_22:6、DG 18:1_18:2、DG 18:1_20:3和DG 20:5_20:5保持不变，而某些DAG，包括DG 16:0_18:1和DG 18:1_18:1，在Δgra38寄生虫中升高，表明对DAG代谢的选择性效应或通过替代途径补偿。

脂肪酸（FA）谱反映脂质代谢破坏的下游效应。Δgra38寄生虫在中链FA（如FA 16:0、FA 16:1、FA 18:0、FA 18:1、FA 18:2）和长链多不饱和FA（如FA 20:2、FA 20:3、FA 22:1、FA 22:2、FA 22:4、FA 22:5和FA 22:6）中显示明显变化。值得注意的是，FA 20:4（花生四烯酸），一种宿主衍生的被弓形虫清除的PUFA，在Δgra38寄生虫中升高。GRA38^WT寄生虫中的FA谱恢复至WT水平，进一步确认GRA38破坏的代谢影响。

GRA38在体外展示PAP活性，关键催化残基突变显著降低此活性

为确定GRA38是否具有PAP活性，重组GRA38-6xHis在大肠杆菌BL21细胞中表达和纯化。使用比色孔雀石绿磷酸盐测定评估GRA38的酶活性，量化PA转化为DAG过程中释放的无机磷酸盐（Pi）。

含GRA38-6xHis的反应平均释放925 pmol游离磷酸盐，确认其PAP活性。相反，非酶对照显示可忽略的磷酸盐释放（-0 pmol）。为评估保守催化残基对PAP活性的贡献，进行GRA38的位点定向诱变产生GRA38^D72/74A突变体。纯化的GRA38^D72/74A-6xHis蛋白显示显著降低的活性，仅释放335 pmol磷酸盐，与野生型GRA38-6xHis相比显著降低。这些结果表明D72和D74对GRA38的PAP活性关键。

为验证GRA38的PAP活性并评估其对酶抑制的敏感性，进行剂量依赖性抑制测定，使用苯乙二醛和普萘洛尔两种已知的PAP抑制剂。GRA38-6xHis与增加浓度（0-4 mM）的每种抑制剂孵育，量化磷酸盐释放。两种抑制剂以剂量依赖性方式抑制PAP活性。在1mM时，普萘洛尔减少磷酸盐释放约29%，而苯乙二醛抑制活性45%。在2-3 mM时，抑制逐步增加，在4 mM时，磷酸盐释放减少85-90%。这些发现确认GRA38是一种功能性PAP酶，其活性依赖于关键催化残基，并可被药理学抑制，支持其在脂质代谢和弓形虫细胞内复制中的潜在作用。

GRA38在弓形虫毒力中起作用

为评估GRA38在弓形虫体内毒力中的作用，研究人员用不同寄生虫菌株的100个速殖子对CD-1小鼠进行腹腔感染：WT（RH Cas9 Luc+△hxgprt）、RH Cas9 Δgra38、RH Cas9 GRA38^WT和RH Cas9 GRA38^D72/74A。

感染野生型寄生虫的小鼠显示显著体重下降和整体健康衰退。所有感染野生型寄生虫的小鼠在研究期间死亡。类似地，所有感染GRA38^WT寄生虫的小鼠在实验期间死亡。相反，五只感染Δgra38寄生虫的小鼠中有三只存活。值得注意的是，所有感染GRA38^D72/74A寄生虫的小鼠在整个实验期间存活。存活小鼠监测感染迹象，所有检测弓形虫特异性抗体阳性，确认成功感染。这些结果表明GRA38在弓形虫毒力中起作用。

本研究确立了GRA38作为弓形虫中的一种PAP，在寄生泡内平衡PA和甘油二酯方面起关键作用。维持这种PA-DAG平衡对寄生虫脂质稳态很重要，影响寄生虫复制、逸出和脂质丰富条件下的整体生存。GRA38在顶复门寄生虫中的高序列保守性表明其脂质调节功能可能进化保守，并可能在适应寄生泡内营养波动中起作用。因此，研究发现将GRA38定位为具有非冗余作用的PAP，保护寄生虫免受PA驱动的脂毒性应激，尤其在脂质丰富时。

GRA38的破坏导致多种PA种类积累，表明转换受损，但也导致几种DAG水平增加，特别是富含PUFAs的DAG。这种模式表明PA-to-DAG转化在Δgra38突变体中未完全废除，而是在特异性或效率上改变。这些发现指向PA-to-DAG轴的选择性扰动，而非统一阻断，并暗示存在补偿或部分冗余的酶，在GRA38缺失时维持某种水平的DAG生产。一个可能的补偿候选是GRA39，一个与GRA38同源、共享结构特征和保守DxDxT/V基序的蛋白。这可以解释脂质组学数据中观察到的某些PA和DAG种类的选择性积累。

更广泛地，DAG、磷脂、溶血磷脂和甘油三酯的积累表明，没有GRA38时，弓形虫难以有效重塑宿主衍生的脂质货物，导致脂质代谢瓶颈和稳态破坏。这些效应在脂质丰富条件下特别显著，Δgra38寄生虫显示复制受损和早期逸出。升高PA水平可能激活不适当的信号级联，缩短复制阶段并触发从宿主细胞的早期逸出。尽管突变体在脂质贫乏条件下显示最小缺陷，但PA和DAG间的不平衡可能随着外源脂质可用性增加而变得更加明显。这突出了GRA38在营养丰富生长期间缓冲寄生虫对抗脂毒性应激中的重要作用。

总之，GRA38似乎作为寄生泡内宿主脂质清除的关键整合者，指导进入的脂质进入生产性生物合成路线，并防止积累不良处理的中间体。其活性在脂质供应充足时特别关键，此时对PA代谢的精确控制帮助寄生虫平衡膜合成、储存和复制时间。未来研究通过双重突变体或比较脂质组学检查GRA38和GRA39的组合，将有必要澄清这些PV定位PAPs间的分工，并完全定义它们对弓形虫脂质稳态调节的贡献。

Δgra38寄生虫中过量PA和改变的磷脂组成也可能破坏寄生泡内正常膜曲率和囊泡运输。因此，对营养运输重要的液泡内网络可能受损，削弱寄生虫存活力。受影响的脂质环境也可能影响寄生虫与宿主细胞器的相互作用，包括宿主ER或线粒体膜的招募，并损害PVM处的适当蛋白定位。PVM组成的改变可能提高寄生虫对宿主免疫反应的脆弱性并降低体内整体适应性。确实，小鼠感染实验显示GRA38破坏时毒力显著降低，突出了PV中正确脂质调节对弓形虫致病性的重要性。

未来研究可能使用代谢通量分析和稳定同位素标记定义GRA38如何与其他寄生虫酶（如TgDGK2、TgLIPIN）协作协调脂质运输和信号传导。剖析GRA38与GRA39的相互作用将澄清它们在PV腔中的分工。此外，表征耦合PA水平至逸出信号的调节级联可能提供对弓形虫如何平衡复制与及时寄生虫退出的更深入洞察。在分子水平理解这些过程可能指向针对寄生虫特异性脂质代谢的治疗策略。此外，评估GRA38在不同生命周期阶段（如缓殖子）的功能仍然是必要的下一步。

除了GRA38，CRISPR筛选还鉴定了几个其他基因为弓形虫如何适应不同脂质环境提供洞察。例如，MAF1（在应激期间抑制RNA聚合酶III以通过下调tRNAs、5S rRNA和U6 snRNA保存资源）与LSm4、Usb1和U1-C（涉及稳定、加工和剪接U6 snRNA）一起，表明弓形虫调节其RNA代谢以应对营养限制。类似地，TGGT1_212930（编码NFU4铁硫簇支架）同样是高置信命中。在速殖子中，来自多个途径的还原当量，包括脂肪酸可用时的β氧化，供给线粒体电子传递链以驱动ATP生产。与此一致，破坏线粒体Fe-S簇生物发生损害呼吸能力和ETC蛋白丰度。TGGT1_212930（NFU4）可能支持包括复合体II的Fe-S客户成熟。因此，我们将NFU4在低血清条件下更强的适应性贡献解释为条件敏感化，例如在脂质贫乏培养基下对呼吸Fe-S酶和/或其应对氧化应激的更大依赖，而非作为氧化磷酸化或线粒体Fe-S生物发生在脂质丰富条件下可废弃的证据。

此外，因为血清中的叶酸大多为蛋白结合，弓形虫在低血清条件下可能更依赖于从头核苷酸合成，这可以解释为什么酶如TGGT1_208090（5-甲酰四氢叶酸环连接酶）和TGGT1_320280（乳清酸5'-单磷酸脱羧酶）在低血清中更关键。

此外，涉及内源性脂质处理的基因TGGT1_310150（TgACS2）、TGGT1_212130（patatin样磷脂酶）和TGGT1_275590（DGAT2L1）在低血清条件下更重要。这些酶促进脂肪酸活化、脂质重塑和甘油三酯合成，全部对能量生产和膜生物合成重要；它们的破坏可能损害能量可用性和膜形成，从而降低寄生虫适应性。相反，在高血清条件下，当外源脂质丰富时，寄生虫较少依赖这些内源性途径，减少其丢失的影响。

最后，四个基因GRA57、GRA70、GRA71和TGGT1_200370（编码法尼基转移酶β亚基）先前鉴定为影响寄生虫在IFNγ刺激HFFs中的适应性，在1%血清中显示增加的适应性缺陷。由于寄生虫脂质代谢在IFNγ刺激HFFs中显著改变，这些基因可能在营养获取和适应营养限制条件中起作用。

而几个高血清命中是合成代谢的，它们的需求可能源于需要延长或去饱和导入的脂肪酸，产生调节性丙二酰辅酶A，或平衡鞘脂库而非简单解毒功能。

总体而言，本研究突出了GRA38作为弓形虫中调节PA-DAG转化的PAP的作用，对脂质储存、膜组成、细胞内复制和致病性有影响。通过揭示GRA38如何在PV中维持脂质平衡，研究发现推进了针对寄生虫特异性途径的更广泛目标，这些途径在不同宿主环境下维持弓形虫感染。抑制GRA38/GRA39的PAP功能的治疗策略可能诱导脂毒性应激或无调节