G蛋白偶联受体介导GTP释放：μ阿片受体信号转导的双向调控新机制

《Nature Communications》：Characterization of the GTPγS release function of a G protein-coupled receptor

本研究揭示了G蛋白偶联受体(GPCR)不仅作为鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)促进GTP结合，还能在激动剂作用下催化GTPγS从G蛋白上解离。通过构建“脉冲-追踪”实验体系，研究人员证实μ阿片受体(MOR)存在一种独特的活性状态，能够介导GTP释放，且该功能具有配体选择性。这一发现挑战了GPCR信号转导的单向循环模型，提出了“三态偶联模型”，为理解受体信号调控的精细机制提供了新视角。

　　

G蛋白偶联受体(GPCR)是细胞表面最普遍和最敏感的信号接收器，它们通过激活异源三聚体G蛋白来传递胞外信号。经典理论认为，激动剂结合受体后，会诱导G蛋白释放GDP，随后GTP结合并激活G蛋白，从而启动下游信号级联反应。在这一过程中，GPCR扮演着鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的角色，其核心功能被认为是单向地促进GDP解离。然而，早期对光感受器视紫红质的研究曾提示，激活的受体可能不仅催化GDP释放，也可能催化GTP的释放，但这一现象背后的机制及其生理意义长期以来未被阐明。

为了深入探究GPCR是否能够调控GTP的解离，Laura M. Bohn和Edward L. Stahl团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们以μ阿片受体(MOR)为模型，设计了一套精密的“脉冲-追踪”实验体系，首次证实了激动剂能够刺激受体介导的GTPγS释放。更重要的是，他们发现这一功能依赖于一个与促进GDP释放不同的、独特的受体活性状态，并且不同激动剂在促进GTP结合和促进GTP释放这两种功能上表现出显著的选择性差异。这一发现不仅重塑了我们对GPCR信号转导的理解，也为开发具有新功能特性的药物提供了理论基础。

关键实验方法

本研究主要采用了一系列体外生化实验来验证受体介导的GTPγS结合与释放功能。核心方法包括：1) 构建“脉冲-追踪”实验体系，在无钠条件下进行GTPγS的初始“脉冲”加载，随后在含钠缓冲液中加入过量未标记GTPγS进行“追踪”，以观察激动剂诱导的放射性GTPγS释放；2) 利用薄层色谱(TLC)技术，排除了GTPγS释放是由硫代磷酸键水解引起的可能性，证实了GTPγS是以完整核苷酸三磷酸的形式解离；3) 采用不可逆拮抗剂β-FNA进行受体烷基化实验，通过测定受体占有率与效应关系，证明了G蛋白与受体的相互作用是催化性的，而非化学计量性的；4) 利用多种药理学模型(Stephenson's Efficacy, Two-State Efficacy, Operational Efficacy)分析激动剂在GTPγS结合与释放功能上的效价和效能差异；5) 在过表达MOR的CHO细胞膜以及人脊髓背角组织样本中验证了上述发现。

研究结果

受体介导的GTPγS结合与释放调控

研究人员首先设计了一个“脉冲-追踪”实验来观察激动剂是否能够诱导GTPγS的释放。在“脉冲”阶段，用激动剂DAMGO刺激MOR表达细胞膜，使其结合放射性³⁵S-GTPγS。随后，在“追踪”阶段，将反应体系稀释10倍，并加入过量未标记GTPγS以阻止³⁵S-GTPγS的再结合。结果显示，在残留的100 nM DAMGO作用下，³⁵S-GTPγS的结合量显著下降，表明激动剂能够诱导GTPγS的释放。当加入饱和浓度的DAMGO(10 μM)时，释放速率和幅度进一步增加。而加入拮抗剂纳洛酮则完全阻断了这一释放过程，证明该反应是受体介导的。为了排除GTPγS水解的可能性，研究人员利用薄层色谱(TLC)分析了反应产物，证实释放的放射性物质是完整的³⁵S-GTPγS，而非水解后的硫代磷酸，从而确认了GTPγS的释放是受体介导的解离过程。

配体介导的GTPγS结合与释放调控

为了探究激动剂浓度对GTPγS释放功能的影响，研究人员比较了DAMGO在促进³⁵S-GTPγS结合和诱导其释放两种功能上的浓度-效应关系。结果显示，DAMGO在这两种反应中均表现出饱和的S型曲线，且其效价(EC₅₀)在两种功能间无显著差异。竞争性拮抗剂纳洛酮在两种反应中均能引起DAMGO效应曲线的右移，且其亲和力(logK)在两种功能中保持一致。这些结果表明，GTPγS的结合与释放功能均受激动剂浓度依赖性的调控，且拮抗剂的作用模式符合经典的竞争性相互作用。

受体储备与GTPγS结合及释放的占有率-效应关系

为了证明G蛋白与受体的相互作用是动态的，而非形成稳定的三元复合物，研究人员利用不可逆拮抗剂β-FNA对受体进行烷基化，以逐步减少功能性受体的数量。结果显示，随着受体被烷基化，DAMGO在GTPγS结合和释放反应中的效价均发生右移。更重要的是，当将最大效应(Emax)与受体占有率进行关联分析时，发现两者呈现出非线性的关系，表明这两种反应均存在显著的受体储备。这意味着，即使只有一小部分受体被激动剂占据，也能产生最大效应，这支持了G蛋白能够与受体解离并重新结合，进行多轮催化的观点，而非被“困”在受体上。

GTPγS结合与释放的配体选择性

研究人员进一步比较了多种阿片类激动剂在GTPγS结合与释放功能上的活性差异。结果显示，不同激动剂在这两种功能上表现出不同的选择性。例如，吗啡和芬太尼在两种功能中的效价相似，但在释放反应中的效能(Emax)显著降低。相反，纳布啡在释放反应中的效能则有所增加。而丁丙诺啡在释放反应中的效价提高了10倍以上。这些结果表明，激动剂能够选择性地偏向于促进GTP结合或GTP释放，这种选择性反映了它们对受体不同活性状态的偏好，这与传统的“两态模型”相矛盾，提示存在更复杂的受体激活机制。

人脊髓背角中的GTPγS结合与释放

为了验证这一机制在生理相关组织中的存在，研究人员在人脊髓背角组织样本中进行了实验。结果显示，在背角膜制备物中，DAMGO和洛哌丁胺均能刺激³⁵S-GTPγS的结合，并且在“脉冲-追踪”实验中，DAMGO也能诱导³⁵S-GTPγS的释放。这表明，受体介导的GTP释放机制不仅存在于过表达细胞系中，也存在于表达内源性MOR的人体组织中，具有生理相关性。

研究结论与讨论

本研究通过一系列严谨的实验，首次证实了GPCR不仅能够促进GTP结合，还能在激动剂作用下催化GTP从G蛋白上解离。这一发现挑战了GPCR信号转导的单向循环模型。基于此，研究人员提出了一个全新的“三态偶联模型”来解释这一现象。该模型认为，受体存在两种不同的活性状态：一种(R)偏好于与GDP结合的G蛋白(GαGDP)相互作用，促进GDP释放和GTP结合；另一种(R*)则偏好于与GTP结合的G蛋白(GαGTP)相互作用，促进GTP释放。激动剂可以根据其结构特性，选择性地稳定其中一种活性状态，从而表现出对GTP结合或GTP释放功能的偏好。

这一机制的发现具有深远的意义。首先，它揭示了GPCR信号转导的精细调控机制，受体不仅是信号的“启动开关”，还可以作为信号的“调节器”，通过调控GTP的释放来塑造信号的强度和持续时间。其次，它解释了配体偏向性信号转导的一种新机制，即激动剂可以通过选择性地偏向于促进GTP结合或GTP释放，来产生不同的功能输出。这为开发更安全、更有效的药物提供了新的靶点和思路。最后，该机制在生理相关组织中的证实，表明它可能是一种普遍存在的信号调控方式，将重塑我们对GPCR生物学功能的理解。