ALK4缺失通过调控TGF-β受体N-糖基化促进癌症进展

《Nature Communications》：Loss of ALK4 promotes cancer progression through regulating TGF-β receptor N-glycosylation

本研究针对ALK4在癌症中频繁下调但其促癌机制不清的问题，揭示了ALK4缺失通过上调ETS1/MGAT5/galectin-3轴增强TGF-β受体N-糖基化及膜稳定性，从而激活TGF-β信号驱动EMT和转移。该发现阐明了TGF-β通路调控新机制，为ALK4缺失癌症提供了靶向N-糖基化的治疗新策略。

　　

在癌症研究领域，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-beta, TGF-β）信号通路扮演着一个复杂且矛盾的角色。在正常细胞和癌症早期，它如同一个“刹车”，抑制细胞增殖并促进其分化与死亡，发挥着肿瘤抑制作用。然而，到了癌症晚期，这个“刹车”却失灵了，TGF-β信号通路反而被癌细胞“劫持”，成为推动肿瘤恶性进展的“油门”，促进上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）、侵袭、转移以及对治疗的抵抗。这种双重身份使得靶向TGF-β通路成为极具吸引力的抗癌策略，但临床开发却因毒副作用和缺乏有效的生物标志物而步履维艰。

与此同时，科学家们注意到，一种名为活化素受体样激酶4（Activin Receptor-Like Kinase 4, ALK4）的蛋白，作为TGF-β超家族的一员，在多种癌症（如胰腺癌和乳腺癌）中经常出现表达下调或突变，且其低表达与患者的不良预后密切相关。尽管ALK4被认为可能是一个肿瘤抑制因子，但它在癌症进展中的具体作用和分子机制一直笼罩在迷雾之中。为什么ALK4的丢失会促进癌症？它是否与那个著名的“双面派”TGF-β通路有关联？解开这些谜团，不仅有助于深入理解癌症的发病机制，还可能为克服TGF-β靶向治疗的困境提供新的思路。

为了回答这些问题，由Gerard C. Blobe教授领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现，ALK4的缺失并不会直接削弱某种抑癌信号，而是意外地打开了一个促进癌症进展的“开关”。这个开关的核心在于一种重要的蛋白质修饰——N-连接糖基化（N-linked glycosylation）。具体来说，ALK4缺失会通过上调转录因子ETS1，进而增加β1,6 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（β1,6 N-acetylglucosaminyltransferase V, MGAT5）的表达。MGAT5负责在细胞膜受体（如TGF-β受体）的糖链上添加特定的分支结构，这种修饰后的受体更容易被另一种名为半乳糖凝集素-3（galectin-3）的蛋白识别并结合，从而在细胞膜上形成稳定的簇状结构，阻碍受体内吞降解。结果，TGF-β受体在细胞表面的稳定性增强，数量增多，导致TGF-β信号通路被过度激活，进而驱动EMT、细胞迁移、侵袭和最终的血行转移。更重要的是，研究团队证明，使用N-糖基化抑制剂（如NGI-1）可以有效逆转由ALK4缺失引发的TGF-β信号增强和癌症进展，这为治疗ALK4低表达的癌症提供了新的潜在治疗策略。

本研究综合运用了生物信息学分析（利用TCGA、CPTAC、METABRIC等公共数据库分析基因表达、突变、拷贝数变异及生存关联）、基因工程细胞模型（通过shRNA/shRNA抵抗基因回补、CRISPR-Cas9基因敲除技术构建ALK4、MGAT5等基因修饰的胰腺癌和乳腺癌细胞系）、体内外功能实验（包括Transwell迁移/侵袭实验、软琼脂集落形成实验、3D形态发生实验、尾静脉/原位移植瘤模型、基因工程小鼠模型）、分子生物学技术（蛋白质印迹、免疫荧光、qRT-PCR、细胞表面生物素化、¹²⁵I-TGF-β结合交联实验、受体内化实验、免疫共沉淀、凝集素阵列、UDP-GlcNAc代谢物检测）、以及定量蛋白质组学分析等关键技术方法。部分患者样本来源于杜克大学生物样本库。

研究结果

低ACVR1B表达与乳腺癌和胰腺癌患者的不良预后相关

研究人员首先在大型癌症患者队列中分析了ALK4的编码基因ACVR1B的变异情况。发现ACVR1B在多种癌症中存在突变和拷贝数丢失，尤其在乳腺癌和胰腺癌中发生率较高。与正常组织相比，乳腺癌和胰腺癌肿瘤组织中的ACVR1B mRNA水平显著降低。重要的是，低ACVR1B表达与乳腺癌患者更短的无复发生存期和胰腺癌患者更短的总生存期显著相关。在乳腺癌亚型中，基底样乳腺癌（通常包括三阴性乳腺癌）的ACVR1B表达水平最低，且低ACVR1B表达与基底样乳腺癌患者更差的预后相关。这种表达下调部分归因于ACVR1B基因启动子区的DNA高甲基化。

ALK4缺失促进癌症进展

为了验证ALK4的功能，研究者在乳腺癌和胰腺癌模型中操纵ALK4的表达。在乳腺癌模型中，敲低ALK4增强了MDA-MB-231细胞在免疫缺陷小鼠体内形成肺转移灶的能力，而回补ALK4则能抑制高转移性LM2亚系和4T1细胞的肺转移，并延长小鼠生存期。在胰腺癌模型中，敲低ALK4虽然轻微抑制了HPNE细胞原位移植瘤的初级生长，但却显著增加了肿瘤的局部侵袭和远处转移发生率。在Kras^LSL-G12D/+; Pdx1-Cre (KC)自发胰腺癌模型小鼠中，额外敲除ALK4 (AKC小鼠) 显著加速了胰腺上皮内瘤变（PanIN）向胰腺导管腺癌（PDAC）的进展，并缩短了小鼠的生存期。这些体内实验证实了ALK4的缺失确实促进了癌症的恶性进展。

ALK4缺失促进EMT、迁移和侵袭

在细胞水平上，敲低或敲除ALK4诱导了乳腺癌和胰腺癌细胞发生EMT，表现为上皮标志物（如E-钙黏蛋白）下调，间质标志物（如波形蛋白、N-钙黏蛋白、纤维连接蛋白）上调。同时，ALK4缺失显著增强了细胞的锚定非依赖性生长（软琼脂集落形成）、迁移、侵袭能力以及在3D胶原中的侵袭结构形成。回补ALK4则能逆转这些表型。这些效应与细胞增殖无关。基因集富集分析（GSEA）对临床数据的分析进一步支持了这些发现，显示低ALK4表达的乳腺癌和胰腺癌患者肿瘤组织中，EMT和侵袭相关基因签名显著富集。

ALK4缺失促进TGF-β信号通路

机制探索发现，ALK4缺失并不影响其经典配体激活素A（activin A）或Nodal等诱导的Smad2/3磷酸化，但却显著增强了TGF-β1刺激下的Smad2/3磷酸化、核转位以及TGF-β靶基因（如SERPINE1）的表达。临床数据关联分析显示，低ALK4表达与活跃的TGF-β信号特征呈正相关。功能挽救实验证实，ALK4缺失所增强的细胞迁移和信号传导依赖于TGF-β通路，因为显性阴性TGF-β受体II型（DN-TβRII）或敲低TβRI/ALK5均可逆转这些效应。此外，抑制激活素A信号并不能模拟ALK4缺失的效果，反而表现出抑制EMT的趋势，表明ALK4缺失对TGF-β信号的增强作用独立于其介导的激活素信号抑制。

ALK4缺失通过调节受体糖基化和稳定性增加TβRI和TβRII的细胞表面表达及复合物形成

进一步机制研究表明，ALK4缺失并不影响TGF-β受体的mRNA水平，但通过¹²⁵I-TGF-β结合交联实验和细胞表面生物素化实验证实，它显著增加了TβRI和TβRII在细胞表面的蛋白水平以及它们之间的复合物形成。相反，过表达野生型或组成型活性ALK4会降低TGF-β受体的表面表达，而激酶失活的ALK4则无此作用，提示ALK4的激酶活性至关重要。研究者将目光投向了蛋白质翻译后修饰——N-糖基化。他们发现，过表达活性ALK4减少了TβRII的糖基化，而敲低ALK4则增加了TβRII的糖基化水平和对内切糖苷酶H（EndoH）的抗性，表明更多受体获得了复杂型N-糖链。抑制N-糖基化（如用衣霉素处理）可降低TGF-β受体的表面表达，并减弱ALK4缺失对TβRII表达的增强效应。

蛋白质组学分析揭示ALK4缺失促进TGF-β信号和癌症进展的潜在机制

对对照和ALK4敲除的PANC-1细胞进行的定量蛋白质组学分析显示，ALK4缺失导致许多差异表达蛋白上调，这些蛋白显著富集于N-连接糖基化、质膜、细胞外区域、TGF-β信号通路、整合素信号和细胞外基质组织等通路。GSEA确认了EMT、细胞迁移和TGF-β信号相关基因集的富集。蛋白质相互作用网络分析发现，一个包含多种糖蛋白和细胞表面受体的最大簇中，出现了半乳糖凝集素-3（LGALS3/galectin-3）的身影，提示其可能扮演重要角色。

ALK4缺失通过galectin-3和MGAT5依赖性途径驱动癌症进展

基于蛋白质组学线索，研究者验证了ALK4缺失确实上调了galectin-3和MGAT5在mRNA和蛋白水平的表达。通过凝集素（PHA-L）染色和pull-down实验证实，ALK4缺失特异性增加了由MGAT5催化的β1,6-GlcNAc分支N-糖链在总蛋白和TβRII上的修饰。这种上调部分源于己糖胺生物合成通路限速酶GFPT2表达增加导致的UDP-GlcNAc底物供应增多。功能上，敲低galectin-3或MGAT5能够抑制ALK4缺失细胞中TGF-β诱导的Smad2磷酸化、锚定非依赖性生长、迁移、侵袭以及EMT相关基因的表达。在体内，敲除MGAT5显著抑制了ALK4缺失型PANC-1细胞在尾静脉注射模型中的肺转移灶形成。机制上，galectin-3通过与MGAT5修饰的糖链结合，阻碍了TβRII的内化，从而稳定了其在细胞表面的存在。

ETS1介导ALK4缺失诱导的MGAT5上调

ALK4缺失如何导致MGAT5上调？研究者排除了经典TGF-β-Smad信号或p38 MAPK通路的作用。通过生物信息学分析和实验验证，发现转录因子ETS1与ACVR1B表达负相关，与MGAT5表达正相关，且在ALK4缺失细胞中表达上调。敲低ETS1可有效抑制ALK4缺失诱导的MGAT5表达升高。在ALK4缺陷的基因工程小鼠胰腺组织中，也观察到了Ets1、Galectin-3和Mgat5的表达增加。

抑制N-连接糖基化有效抑制ALK4缺失驱动的TGF-β信号和肿瘤转移

最后，研究者测试了靶向N-糖基化过程的治疗潜力。两种N-糖基化抑制剂NGI-1和葡萄糖胺（glucosamine）均能降低MGAT5催化的糖链水平，抑制TGF-β信号传导、细胞侵袭和锚定非依赖性生长。在体内实验中，NGI-1处理与TβRI抑制剂LY2157299一样，能显著减少由ALK4缺失引起的肺转移灶形成。

结论与讨论

本研究深入揭示了ALK4作为一个新型TGF-β信号通路负调控因子的重要作用。它阐明了ALK4缺失通过上调ETS1→MGAT5→galectin-3轴，增强TGF-β受体N-糖基化和膜稳定性，从而反常地激活TGF-β信号通路，促进EMT和癌症进展的完整分子机制。这一发现不仅深化了对TGF-β通路复杂调控网络的理解，更重要的是，它为治疗由ALK4缺失驱动的恶性肿瘤（特别是胰腺癌和三阴性乳腺癌）提供了新的思路和潜在的生物标志物。针对N-糖基化过程的抑制剂（如NGI-1）展现出良好的治疗前景，有望成为选择性抑制TGF-β驱动性癌症进展的新策略，同时可能避免直接靶向TGF-β通路本身所带来的毒副作用。该研究强调了在特定遗传背景下靶向代谢-糖生物学-信号转导交叉通路的重要性，为未来精准抗癌治疗的发展提供了有价值的见解。