核仁激光显微切割测序(NoLMseq)揭示单细胞水平基因组-核仁互作动态及其在细胞状态与应激响应中的作用

《Nature Communications》：Single-cell dynamics of genome-nucleolus interactions captured by nucleolar laser microdissection (NoLMseq)

本研究针对当前缺乏能够在单细胞及核仁应激条件下绘制核仁相关域(NADs)的技术难题，开发了名为NoLMseq的新方法，该方法结合激光捕获显微切割与DNA测序，成功在单细胞分辨率下揭示了基因组与核仁互作的动态特征。研究发现胚胎干细胞中存在具有不同染色质状态的亚群，NADs主要以单等位基因形式接触核仁，且核仁完整性是维持基因组三维结构的关键。该技术为研究生理与病理状态下核仁应激对基因组组织的调控提供了强大工具。

　　

在细胞核这个微小的宇宙中，基因组的三维空间排列并非随机，而是精密组织化的，这种结构与基因的功能调控息息相关。其中，核仁作为细胞核内最显著的无膜结构，不仅是核糖体生物合成的中心，也被发现与基因组中被称为核仁相关域(Nucleolar-Associated Domains, NADs)的染色质区域存在密切的空间关联。这些NADs通常富含抑制性染色质标记，类似于核纤层相关域(Lamina-Associated Domains, LADs)，暗示核仁可能作为一个特殊的抑制性区室，参与基因表达的调控。然而，与已被广泛研究的LADs相比，NADs的探索相对滞后，这主要源于技术上的瓶颈：核仁缺乏膜结构，使得其相关DNA的精确分离和鉴定变得异常困难。

现有的NADs研究方法，如生化纯化核仁后测序、核仁-DamID (H2B-Dam-NoLS)、核仁-TSA-seq和O-MAP等，虽然取得了一定进展，但都存在明显局限。它们无法应用于单细胞分析，也无法研究在诸如营养剥夺、DNA损伤等应激条件下，核仁结构发生剧烈改变（即核仁应激）时，基因组与核仁的互作如何响应。因为在这些情况下，核仁变得脆弱难以纯化，或者相关标记蛋白的表达和定位会受到影响。因此，基因组如何响应核仁的结构和功能变化，这一关键科学问题长期以来悬而未决。

为了解决这一挑战，来自瑞士苏黎世大学分子疾病机制系的Raffaella Santoro教授团队及其合作者，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为核仁激光显微切割测序(Nucleolar Laser Microdissection sequencing, NoLMseq)的革命性技术，首次实现了在单细胞水平上对单个核仁周围基因组互作的高精度测绘。这项研究不仅验证了NADs的抑制性特征，更揭示了此前无法探测的基因组组织新层面，包括胚胎干细胞(ESCs)中存在的异质性NADs亚群、NADs predominantly monoallelic（单等位基因）的接触模式，以及核仁应激引发的广泛染色体重构，强调了核仁完整性在维持三维基因组结构和基因表达调控中的核心作用。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几项关键技术：1. 核仁激光显微切割(NoLMseq)：核心创新技术，通过激光从固定于薄膜上的单个细胞中精确切割并分离单个核仁及其周边染色质。2. 单细胞全基因组扩增(WGA)：对微量核仁DNA进行扩增，以满足后续测序要求。3. 高通量DNA测序与生物信息学分析：对扩增产物进行建库和测序，利用SICER2等工具在100 kb分辨率下识别NADs，并计算核仁接触频率(Contact Frequency, CF)。4. 等位基因特异性分析：利用源自CAST和S129品系杂交的F123胚胎干细胞系，结合SNP分型，区分母源和父源等位基因的核仁接触情况。5. 多组学数据整合分析：整合了RNA测序(RNA-seq)、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)（针对H3K9me2、H3K27ac等组蛋白修饰）、单细胞RNA测序(scRNA-seq)以及DNA荧光原位杂交(DNA-FISH)等数据，用于验证和深入阐释NoLMseq的发现。6. 细胞模型与处理：使用了小鼠胚胎干细胞(E14系)、由其分化而来的神经祖细胞(NPCs)以及经低剂量放线菌素D(Actinomycin D, ActD)处理诱导核仁应激的ESCs等多种细胞模型。

NoLMseq identifies NADs in single cells

研究团队首先建立了NoLMseq技术流程。他们将小鼠胚胎干细胞(ESCs)培养在可激光切割的聚酯薄膜上，通过明场显微镜识别核仁，利用激光显微切割技术精确分离单个核仁，随后对捕获的DNA进行全基因组扩增和测序。通过对53个高质量的单核仁样本进行分析，研究人员在100 kb基因组分辨率下成功绘制了NADs图谱。他们定义了核仁接触频率(CF)，即包含特定基因组序列的微切割核仁的比例，并设定CF > 20%为NADs的阈值，确保了极低的假阳性率。结果表明，含有核糖体DNA (rDNA)的染色体（rDNA-chromosomes）其NADs的CF显著高于不含rDNA的染色体，且单个核仁中NADs的平均覆盖率约为15%，低于以往群体细胞研究得出的~30%。这与单细胞分析能区分接触与否的异质性相符。通过与国际上已发表的seqFISH+（连续荧光原位杂交）数据进行对比，发现NoLMseq测得的CF与基因组位点到核仁标记蛋白Fibrillarin的距离呈负相关，验证了该技术的准确性。

NADs identified by NoLMseq correspond to repressive chromatin domains

对NoLMseq鉴定出的NADs进行特征分析，证实它们确实是抑制性染色质区域。与活跃的A区室(A compartment)相比，NADs显著富集抑制性组蛋白标记H3K9me2，而缺乏活跃标记如H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3，其内的基因表达水平也普遍较低。然而，一个有趣的发现是，一些高表达的基因，特别是核糖体蛋白(Ribosomal Protein, RP)基因和转运RNA (tRNA)基因，却显示出较高的核仁CF，提示核仁邻近性可能对调控这些翻译机器关键组分的表达具有特殊作用，并非所有NADs内的基因都处于完全抑制状态。此外，NADs可进一步分为只与核仁接触的NAD-only（Type-1）和既可接触核仁也可接触核纤层的NAD/LAD（Type-2）。NAD-only区域的CF高于NAD/LAD，且高CF的NAD-only区域表现出更低的H3K27ac水平和更高的H3K9me2水平，进一步证实了NoLMseq识别NADs的精确性。

Detachment of NADs upon differentiation into NPCs correlates with gene activation

为了检验NoLMseq在不同细胞类型中的适用性，研究人员将其应用于由ESCs分化而来的神经祖细胞(NPCs)中。结果显示，NPCs的NADs覆盖率低于ESCs，且NADs的细胞间相似性更高，这与分化细胞染色质更为刚性和稳定的特性一致。更重要的是，研究发现了在ESCs中特异性存在而在NPCs中脱离核仁的NADs (ESCsp-NADs)。这些区域内的基因在NPCs中的表达显著上调，其功能富集于神经系统发育等过程。这表明基因从核仁脱离与其激活相关，提示核仁在维持基因抑制状态中可能扮演了主动角色。这一发现是此前基于细胞群体的Nucleolar-DamID研究未能检测到的，凸显了NoLMseq在定量分辨NADs关联强度方面的优势。

ESCs are composed of two populations with distinct nucleolar contacts

利用NoLMseq的单细胞分辨率优势，研究人员深入探讨了ESCs中基因组-核仁互作的异质性。通过对单细胞NADs覆盖模式进行层次聚类分析，发现ESCs主要存在两个群体，它们在rDNA染色体的核仁接触上呈现互斥模式：群体1中染色体12和19的接触较多，而群体2中染色体16和18的接触较多。两组细胞的NADs在组蛋白修饰上也存在差异，群体1的NADs具有更强的抑制性特征（H3K9me2富集，活跃标记贫乏）。基因本体(GO)分析显示，群体2特异性NAD基因与发育和多能性通路相关，而群体1的则与代谢和信号通路相关。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步分析发现，群体2的高接触基因与多能性因子Nanog和Sox2共表达，而群体1的基因则更多在代表低多能性状态的细胞簇中表达。这揭示了ESCs在核仁周围基因组组织上存在显著异质性，且这种异质性与细胞不同的发育潜能状态相关联。

Nucleolar integrity is required for genomic contacts with nucleoli

核仁结构高度动态，易受应激影响。研究人员用低剂量放线菌素D(ActD)处理ESCs诱导核仁应激（其特征是rDNA转录抑制、核仁帽形成和核仁蛋白如NPM1的释放）。NoLMseq分析显示，应激后ESCs的NADs覆盖率从15%显著下降至10%，表明核仁完整性受损导致大量基因组区域与核仁脱离。DNA-FISH实验验证了这一结果。值得注意的是，在应激条件下，rDNA染色体着丝粒邻近区域的NADs覆盖率反而相对增加，而非rDNA染色体的相应区域则减少，提示染色体围绕应激核仁发生了重组。RNA-seq分析发现，位于高置信度NAD-only区域(CF > 30%)的基因，在ActD处理后上调的比例(17%)高于下调比例(9%)，而非NAD基因的上下调比例相近。这表明核仁完整性的丧失可能导致部分NAD基因的去抑制，核仁的抑制性功能在应激条件下可能被削弱。

Genomic contacts with nucleoli are predominantly mono-allelic

以往研究均假设NADs是双等位基因接触核仁。为了探究等位基因特异性，研究团队将NoLMseq应用于杂交来源的F123-ESCs（父源为CAST，母源为S129），通过区分单核苷酸多态性(SNPs)来分别分析母源和父源等位基因的核仁接触。令人惊讶的是，绝大多数(86%)的NADs是单等位基因接触的，且父源和母源等位基因的分布比例相近。rDNA染色体的双等位基因NADs比例远高于非rDNA染色体。DNA-FISH实验也证实了单等位基因接触模式的存在。考虑到这种普遍的 monoallelic（单等位基因）接触，每个细胞中实际的NADs二倍体基因组覆盖率仅为5.6%（约297 Mbp），远低于此前群体研究估算的30%。此外，双等位基因NADs比单等位基因NADs处于更强的抑制性染色质状态（H3K9me2更高，H3K27ac和H3K4me3更低），基因表达也更低，进一步支持了核仁作为抑制性区室的功能。分析还发现，NADs的 monoallelic 分布并非 parent specific（亲本特异性），即在一个细胞中可能是父本等位基因接触，在另一个细胞中则可能是母本等位基因接触。

综上所述，这项研究开发的NoLMseq技术突破了现有方法的局限，首次实现了在单细胞及核仁应激条件下对基因组-核仁互作的高精度解析。研究获得了一系列重要发现：NADs在单细胞中主要以单等位基因形式接触核仁，修正了以往基于群体平均或假设得出的认知；胚胎干细胞在核仁周围基因组组织上存在异质性，并与细胞多能性状态相关；基因从核仁脱离伴随其激活，提示核仁可能主动参与基因抑制维持；核仁结构的完整性是维持正常基因组三维组织所必需的，核仁应激会导致广泛的染色体重构并可能引发NAD基因的去抑制。这些发现深刻揭示了核仁在三维基因组组织和基因表达调控中前所未有的动态性和复杂性，不仅深化了对核仁功能的理解，也为研究发育、衰老及疾病（如癌症、神经退行性疾病）中核仁异常如何通过影响基因组三维结构进而驱动病理过程提供了全新的视角和强大的技术手段。NoLMseq作为一个关键工具，必将推动三维基因组学与核仁生物学研究进入一个新的阶段。