分段丝状细菌粘附尖端在单细胞向丝状发育过程中的结构转变

《Nature Communications》：Segmented filamentous bacteria undergo a structural transition at their adhesive tip during unicellular to filament development

本研究针对分段丝状细菌(SFB)与宿主上皮细胞粘附的分子机制尚不明确的问题，通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)和断层扫描(cryo-ET)技术，首次揭示了SFB在从单细胞胞内后代(IO)向丝状体发育过程中，其粘附尖端会发生从S层到毛发样结构(HLS)的形态转变。研究发现了一个IO特异性的S层，并证实主要Th17抗原在丝状体尖端特异性可及。该研究为理解SFB-宿主互作及其免疫调节功能提供了关键结构基础。

　　

在我们的肠道深处，居住着数以万亿计的微生物，它们与我们的健康息息相关。其中，有一类名为分段丝状细菌(Segmented Filamentous Bacteria, SFB)的微生物尤为特殊。它既不是典型的致病菌，也不是普通的共生菌，而是一个关键的免疫系统“训练师”。SFB通过其独特的钩状尖端紧密粘附于回肠上皮细胞，能够有效地诱导宿主产生Th17细胞和特异性抗体，从而促进免疫系统发育并抵抗病原体入侵。然而，这种至关重要的粘附过程是如何在分子和结构水平上实现的，长期以来一直是一个未解之谜。由于SFB难以进行体外培养且缺乏遗传操作工具，研究人员对其表面结构和粘附机制的认识非常有限。

为了揭开SFB粘附之谜，由Ana Raquel Cruz、Benedikt H. Wimmer、Pamela Schnupf等研究人员组成的国际团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们利用先进的冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)和冷冻电子断层扫描(cryo-electron tomography, cryo-ET)技术，首次以近原子分辨率观察了SFB在自然水合状态下的精细结构，重点关注了其生命周期中一个关键阶段——从单细胞形态的胞内后代(Intracellular Offsprings, IOs)生长为丝状体的过程。

研究人员主要运用了以下关键技术：从单关联小鼠和大鼠体内纯化SFB；通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)和冷冻电子断层扫描(cryo-ET)对SFB进行高分辨率成像和三维重构；重组表达并纯化SFB的主要Th17抗原，并制备特异性纳米抗体(VHH)进行免疫金标记和免疫荧光定位；利用氢/氘交换质谱(Hydrogen/Deuterium eXchange-Mass Spectrometry, HDX-MS)进行纳米抗体表位作图。

结果

单细胞SFB被S层包围

研究人员发现，从小鼠和大鼠分离的SFB IOs表面均覆盖着一层规则排列的表面层(S-layer)。该S层位于细胞壁外侧，由重复的新月形元件和间距约8纳米的球状密度组成，其形态和间距与已知的其他细菌S层相似。这表明S层是IOs的一个保守表面特征。

SFB尖端经历形态发育转变

研究的关键发现是SFB尖端表面结构随发育阶段的动态变化。研究人员将SFB分为五个连续阶段：阶段1（小IOs，尖端完全被S层覆盖）；阶段2和3（IOs，尖端S层逐渐被更长、无序的毛发样结构disordered hair-like structures取代）；阶段4和5（较长IOs和所有丝状体，尖端和细胞体完全被一种形态不同的有序毛发样层hair-like layer, HLL覆盖）。这种从S层到HLL的转变是快速的，且无序毛发样结构仅出现在粘附相关的尖端，提示其可能参与宿主细胞附着。

发育转变在不同宿主体内的SFB中保守

大鼠来源的SFB同样展示了从IOs的S层到丝状体HLL的保守形态转变，证明了这一发育过程在不同宿主SFB中的普适性。不过，大鼠SFB的IOs中具有完整S层的比例更高，且其尖端通常较短，提示宿主环境可能影响SFB某些形态特征的发育。

丝状体相关的毛发样层由重复亚基组成

对丝状体HLL的精细结构分析表明，它由规则排列的毛发样亚基构成，可分为内层(I-HLL)和外层(O-HLL)，亚基间距约为5纳米，显著小于S层的亚基间距（8纳米）。这进一步证实HLL是区别于S层的一种新型、有序的细菌表面结构。

主要Th17抗原在SFB丝状体尖端可及

通过特异性纳米抗体(VHH-Fc)进行定位研究，发现主要的Th17和B细胞抗原(Th17Ag)在SFB丝状体上的可及性惊人地局限于尖端区域（93%的标记丝状体）。而在IOs上，该抗原的标记则较为弥散。经去垢剂处理破坏表面结构后，纳米抗体的标记几乎完全消失，但多克隆抗体仍能广泛标记。这表明Th17Ag是一个普遍存在的细胞壁相关蛋白，但其在丝状体上的可及性被HLL所限制，仅在尖端暴露。

在异源宿主中生长影响SFB粘附尖端形态

当小鼠SFB在不支持其粘附的大鼠肠道内生长时，其尖端长度显著变短，且阶段2 IOs（S层部分被无序毛发样结构取代）的比例显著增加。这表明宿主特异性信号或粘附本身可能促进了SFB尖端结构的完全发育和伸长。

讨论与结论

本研究首次系统揭示了SFB在从单细胞向丝状体发育过程中，其粘附尖端表面结构发生的保守的、动态的形态转变。研究鉴定出了两个主要的表面结构：一个覆盖早期IOs的典型S层，以及一个覆盖丝状体的、由更紧密排列亚基构成的新型毛发样层(HLL)。尤为重要的是，在转变过程中，尖端特异性地出现了更长的、无序的毛发样结构，其出现的时间和位置提示它们很可能直接参与了初始的宿主细胞附着。

此外，研究还发现一个关键的免疫原性蛋白——Th17Ag，虽然遍布SFB表面，但其免疫可及性在丝状体上被严格限制于尖端。这揭示了SFB丝状体尖端是一个独特的免疫“热点”，细胞壁相关抗原在此暴露，可能与局部免疫激活有关。在异源宿主中的生长实验进一步表明，宿主环境或粘附事件本身对SFB尖端形态的正常发育具有重要调节作用。

这项研究突破了技术限制，以前所未有的细节描绘了SFB的表面结构世界，为理解SFB如何通过其独特的表面结构介导与宿主的亲密对话奠定了坚实的结构基础。未来对SFB表面结构的分子组成和功能的深入研究，将有望揭示其强大免疫调节能力的新机制，并为靶向微生物-宿主互作的干预策略提供新的思路。