利用简单磷酸供体酶法合成RNA治疗关键构建单元

《Nature Communications》：Enzymatic synthesis of key RNA therapeutic building blocks using simple phosphate donors

为解决RNA治疗药物生产中核苷三磷酸(NTP)合成效率低、成本高且依赖ATP的问题，研究人员开发了一种新型无ATP生物催化平台。该研究通过工程化酸性磷酸酶(PhoC)、多聚磷酸激酶(PPK)和乙酸激酶(AcK)级联反应，成功将易得核苷转化为含2'-甲氧乙基(2'-MOE)、2'-氟等治疗相关修饰的NTPs，并证明粗品NTPs可直接用于酶促寡核苷酸合成。该技术为RNA药物的规模化、可持续生产提供了新策略。

　　

随着mRNA疫苗在新冠疫情期间的快速应用，以及反义寡核苷酸(ASO)和小干扰RNA(siRNA)在癌症和遗传性疾病治疗领域的不断突破，RNA治疗药物正迎来爆发式增长。然而，这些前沿疗法的规模化生产却面临着一个关键瓶颈——如何高效、经济且可持续地合成其核心构建单元核苷三磷酸(NTPs)。传统的化学合成方法往往步骤繁琐，需要使用对空气敏感的有毒试剂，并且难以适用于含有复杂修饰（如2'-位修饰）的NTPs。而现有的生物催化方法虽然前景广阔，但其严重依赖三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸供体，这不仅增加了成本，更致命的是，当合成的NTPs（如2'-氟-ATP）在结构上与ATP相似时，微量的ATP残留就会严重污染最终产物，导致下游寡核苷酸合成失败。因此，开发一种不依赖ATP、且能高效合成多种治疗性修饰NTPs的新方法，成为了推动RNA治疗产业发展的迫切需求。

针对这一挑战，曼彻斯特大学的Sarah L. Lovelock教授团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们成功构建了一个全新的无ATP生物催化平台，仅使用廉价易得的焦磷酸盐和多聚磷酸盐作为磷酸供体，就能将常见的修饰核苷一步法转化为高纯度的NTPs。该技术的核心在于一条精巧的三酶级联反应路线：首先，工程化的酸性磷酸酶(PhoC)负责给核苷装上第一个磷酸基团，生成核苷一磷酸(NMP)；接着，多聚磷酸激酶(PPK)接力，利用多聚磷酸将NMP转化为核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)的混合物；最后，乙酸激酶(AcK)上场，将剩余的NDP“充电”成最终的NTP产品，从而显著提高产率。

为开展此项研究，团队主要运用了以下关键技术：1) 蛋白质工程定向进化，改造酸性磷酸酶(PhoC)以拓宽其对多种修饰核苷的底物特异性；2) 酶学动力学分析，评估工程酶的性能；3) X射线晶体学与分子对接模拟，解析酶结构并阐释其催化机制；4) 多酶级联反应体系的设计与优化，实现从核苷到NTP的一锅法合成；5) 分析型与制备型高效液相色谱(HPLC)，用于反应进程监控和产物纯化鉴定；6) 酶促寡核苷酸合成技术，验证所合成NTPs的生物活性。

结果与讨论

工程化酸性磷酸酶(PhoC)

研究起点是选择一个已知的酸性磷酸酶突变体(PhoC_1)，该酶能利用焦磷酸盐将核苷磷酸化，但面对治疗中常见的2'-O-甲氧乙基腺苷(2'-MOE-A)时，其活性大幅降低。为此，研究人员对PhoC_1进行了两轮定向进化，通过定点饱和突变筛选了超过3500个变异体。最终获得的优化变体PhoC_4包含了A90E、N151A和D154L三个关键突变，其对2'-MOE-A的催化效率(k_cat/K_M)提升了9倍。晶体结构分析表明，这些突变位于酶活性中心附近的可变环区，可能通过调节底物结合口袋的构象，更有利于磷酸化反应而非产物的水解，从而提高了目标NMP的产率。底物谱测试显示，PhoC_4不仅能高效磷酸化多种2'-修饰核苷（如2'-氟、2'-甲氧基及锁核酸），还能耐受碱基修饰和3'-保护基团，展现出卓越的普适性。

用于修饰NTP合成的优化平台

在获得高效的NMP后，研究人员筛选了一系列多聚磷酸激酶(PPK)同源酶，以寻找能将各种修饰NMP进一步磷酸化为NDP/NTP的合适催化剂。测试发现，对于所有测试的NMP底物，都能找到具有活性的PPK同源酶。为了将反应推向完全，他们引入了来自嗜热菌的乙酸激酶(AcK)，利用乙酰磷酸作为磷酸供体，将反应体系中剩余的NDP高效地转化为NTP。通过这三酶联用的策略，他们成功地从9种结构多样的修饰核苷合成了相应的NTPs，转化率在40%至82%之间，证明了该平台的广泛适用性。

酶法合成NTPs在寡核苷酸合成中的应用

为展示该技术的实用价值，研究团队进行了克级规模的2'-MOE-ATP合成。在优化条件下，从163毫克起始核苷出发，以低于0.06 mol%的极低酶用量，实现了76%的转化率，并通过离子交换色谱纯化，以65%的分离收率获得了纯度高于99%的2'-MOE-ATP。更重要的是，他们将此酶法合成的2'-MOE-ATP直接用于一种新型的酶促寡核苷酸合成体系（该体系使用工程化DNA聚合酶和内切酶V协同催化），成功合成了聚2'-MOE-A五聚体，其效果与使用化学合成并经硅胶纯化的2'-MOE-ATP相当。为了进一步凸显无ATP方法的优势，他们合成了2'-氟-ATP，并尝试直接使用粗反应液进行寡核苷酸合成，结果成功获得了目标八聚体。对比实验表明，即使体系中存在1-10 mol%的ATP杂质，也会导致产物复杂化，这充分证明了避免ATP污染对于保证寡核苷酸合成纯度的极端重要性。

结论

本研究成功建立了一种可持续、可放大的生物催化新方法，用于合成RNA治疗所需的关键NTPs构建单元。该方法的突出优势在于完全摆脱了对ATP的依赖，避免了由此带来的纯化难题和产物污染问题。通过蛋白质工程手段获得的广谱底物适应性PhoC变体，是该平台成功的关键。该技术平台具有高度的灵活性，能够合成携带多种治疗相关修饰（包括2'-修饰和3'-保护基团）的NTPs。未来，通过进一步优化各酶的催化性能、统一其最适反应条件，以及开发基于结晶的纯化工艺，该过程的效率和经济性有望得到进一步提升。尤为重要的是，本研究证实了粗品NTPs可直接用于下游合成，这为RNA治疗药物的低成本、一体化制造开辟了全新路径。相较于传统化学方法，该生物催化策略在可持续性、原子经济性和过程简化方面展现出巨大潜力，有望成为支撑下一代RNA治疗药物生产的核心技术。