DUX4基因网络激活通过抑制肌钙蛋白/OSTN表达损害面肩肱型肌营养不良症肌管对电脉冲刺激的适应性反应

《Scientific Reports》：Adaptive response to electrical pulse stimulation is impaired in FSHD myotubes by DUX4 gene network activation

本研究针对面肩肱型肌营养不良症(FSHD)中DUX4基因异常表达如何导致肌细胞功能缺陷这一核心问题，开展了电脉冲刺激(EPS)模拟运动条件下肌管适应性反应的研究。研究发现，FSHD患者及基因工程突变肌管在EPS刺激下，无法正常上调肌钙蛋白(TTN)和肌保护性肌因子肌钙蛋白(OSTN)的表达，并伴随肌节结构紊乱加剧。通过过表达DUX4下游关键靶点LEUTX，成功在正常细胞中重现了上述缺陷表型。该研究揭示了DUX4基因网络激活是导致FSHD肌细胞适应性反应受损的细胞自主性缺陷，为理解FSHD的病理机制提供了新视角。

　　

面肩肱型肌营养不良症(FSHD)是一种常见的遗传性肌肉疾病，患者的面部、肩部和上臂肌肉会逐渐萎缩无力。尽管科学家们已经知道，这种疾病与一个名为DUX4的胚胎转录因子的异常表达有关，但DUX4在极少数肌细胞中的低水平表达，如何导致整个肌肉组织的进行性损伤，一直是一个未解之谜。更令人困惑的是，FSHD患者的肌肉在发育过程中看起来是正常的，问题似乎出在肌肉成熟或使用之后。为了解开这个谜团，研究人员将目光投向了肌细胞对“运动”的适应性反应。

为了模拟运动对肌细胞的影响，研究人员采用了一种名为电脉冲刺激(EPS)的技术，它就像在体外给肌细胞“做运动”。他们比较了健康人来源的肌细胞和FSHD患者来源的肌细胞在EPS刺激后的反应。结果发现，健康肌细胞在“运动”后，会激活一系列与肌肉收缩和结构相关的基因，而FSHD肌细胞则反应迟钝，无法有效上调这些基因。更具体地说，一个名为肌钙蛋白(OSTN)的肌因子，在健康细胞中能被EPS强烈诱导，但在FSHD细胞中却几乎不表达。肌钙蛋白是一种已知的运动反应性肌因子，具有保护肌肉、增强耐力的作用。

为了确认这种缺陷确实是FSHD基因突变导致的，研究人员使用了基因编辑技术，在健康的肌细胞中引入了与FSHD相关的突变，构建了等基因的突变细胞系。这些工程化的突变细胞，特别是同时携带D4Z4重复序列收缩和SMCHD1基因突变的双突变细胞，也表现出了与FSHD患者细胞相同的缺陷：它们同样无法在EPS刺激下上调肌钙蛋白(OSTN)的表达。

为了进一步揭示DUX4基因网络是如何导致这些缺陷的，研究人员将目光锁定在LEUTX上。LEUTX是DUX4下游一个关键的转录因子。当他们在健康肌细胞中过表达LEUTX时，即使没有DUX4的存在，也足以重现FSHD的缺陷表型：这些细胞同样无法在EPS刺激下上调肌钙蛋白(OSTN)和肌联蛋白(TTN)的表达。这表明，LEUTX作为DUX4的下游执行者，是导致肌细胞适应性反应受损的关键分子。

除了基因表达的改变，研究人员还利用高分辨率的图像分析技术，对肌细胞内部的肌节结构进行了定量分析。他们发现，EPS刺激对健康肌细胞是有益的，能使肌节排列得更加整齐有序。然而，对于FSHD患者细胞和双突变细胞，EPS反而加剧了肌节结构的紊乱。这种结构上的缺陷，与肌细胞无法产生足够的力量有关，这或许能解释为什么FSHD患者会感到肌肉无力。

这项研究首次揭示了FSHD肌细胞存在一种细胞自主性的功能缺陷：它们无法对电刺激（模拟运动）产生正常的适应性反应。这种缺陷表现为肌保护性基因（如肌钙蛋白OSTN）的诱导失败，以及肌节结构的进一步紊乱。更重要的是，研究证明，DUX4下游的转录因子LEUTX是导致这一缺陷的“罪魁祸首”。这一发现不仅深化了我们对FSHD病理机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了重要的靶点。

关键实验方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 细胞模型：使用永生化的人骨骼肌成肌细胞系，包括健康对照、FSHD患者来源细胞，以及通过CRISPR-Cas9技术在健康细胞背景中构建的等基因突变细胞系（D4Z4重复序列收缩和/或SMCHD1突变）。2. 电脉冲刺激(EPS)：在肌管分化晚期（第10天）施加12小时的电脉冲刺激，模拟运动或神经激活。3. 功能与结构分析：利用微电极阵列(MEA)系统评估肌管收缩功能；通过免疫荧光染色结合自动化图像分析软件(ZlineDetection)对肌节结构和Z线排列进行定量分析。4. 分子生物学技术：通过RNA测序(RNA-seq)和实时定量PCR(RT-qPCR)分析基因表达谱；通过慢病毒转导构建可诱导的LEUTX过表达细胞系。

研究结果

EPS在对照和FSHD肌管中引发不同的基因表达变化

为了研究FSHD肌管对电刺激的适应性反应，研究人员对分化成熟的健康对照和FSHD肌管施加了12小时的EPS，并在刺激后6小时收集样本进行RNA测序(RNA-seq)分析。结果显示，EPS在两种细胞中都引起了显著的基因表达变化，但FSHD肌管的反应模式与健康对照截然不同。具体而言，在健康对照细胞中，EPS显著上调了与肌肉收缩和肌节组织相关的基因，如肌联蛋白(TTN)和FHL1。然而，这些基因在FSHD细胞中对EPS的反应微弱或缺失。相反，一些与细胞周期相关的基因在FSHD细胞中被异常上调。这表明，FSHD肌管对电刺激的转录组反应存在根本性缺陷，无法正常激活肌肉功能相关基因。

EPS诱导的收缩性激活在FSHD肌管中受损

为了验证基因表达缺陷是否导致功能异常，研究人员利用微电极阵列(MEA)系统评估了肌管的收缩功能。他们发现，在施加EPS后，健康对照肌管的平均搏动幅度显著增加，表明其收缩功能得到了增强。然而，FSHD肌管的搏动幅度在EPS后没有明显变化。这一结果直接证明，FSHD肌管无法通过电刺激来促进其收缩功能的发展。

患者细胞的肌节结构偏差在EPS后更加明显

研究人员通过免疫荧光染色和自动化图像分析，对肌管的肌节结构进行了定量评估。他们发现，在没有EPS刺激时，FSHD肌管的Z线排列有序度(OOP)已经略低于对照。在施加EPS后，健康对照肌管的Z线排列变得更加整齐有序，而FSHD肌管的Z线排列则进一步紊乱，导致其与对照之间的差异更加显著。这表明，EPS对健康肌管的结构是有益的，但对FSHD肌管的结构却是有害的，加剧了其肌节结构的紊乱。

EPS诱导的Z线紊乱在等基因FSHD突变肌管中重现

为了排除个体差异的影响，研究人员在等基因背景下验证了上述发现。他们使用了通过CRISPR-Cas9技术在健康细胞中构建的突变细胞系，包括仅携带D4Z4重复序列收缩的单突变细胞，以及同时携带D4Z4收缩和SMCHD1突变的双突变细胞。结果显示，在没有EPS时，双突变细胞的Z线排列有序度显著低于对照。在施加EPS后，对照细胞的Z线排列变得更加有序，而双突变细胞的Z线排列则进一步恶化。这一结果在等基因背景下证实，FSHD相关的基因突变确实会导致肌管对电刺激产生异常的结构反应，即EPS会加剧肌节结构的紊乱。

FSHD在OSTN（肌钙蛋白）诱导方面存在缺陷

研究人员通过RT-qPCR验证了RNA-seq的结果，确认了肌联蛋白(TTN)和FHL1在FSHD细胞中诱导失败。更重要的是，他们发现一个名为肌钙蛋白(OSTN)的肌因子基因，在健康对照细胞中被EPS强烈诱导，但在FSHD患者细胞和双突变细胞中，其诱导被显著抑制。肌钙蛋白是一种已知的运动反应性肌因子，具有保护肌肉、增强耐力的作用。在仅携带D4Z4收缩、DUX4靶基因激活水平较低的单突变细胞中，OSTN的诱导是正常的。这表明，OSTN诱导的缺陷与DUX4靶基因网络的激活程度呈负相关。

LEUTX过表达足以损害对照细胞对EPS的反应

为了直接证明DUX4基因网络是导致上述缺陷的原因，研究人员在健康对照细胞中过表达了LEUTX，这是DUX4下游的一个主要靶点转录因子。结果显示，LEUTX的过表达足以在健康细胞中重现FSHD的表型：这些细胞在EPS刺激下，无法正常上调肌钙蛋白(OSTN)和肌联蛋白(TTN)的表达。此外，LEUTX的过表达也导致了肌节结构的紊乱，特别是在EPS刺激后，Z线的排列有序度显著恶化。这些结果表明，LEUTX作为DUX4的下游执行者，是导致FSHD肌管适应性反应受损的关键分子。

研究结论与讨论

本研究通过模拟运动的电脉冲刺激(EPS)模型，揭示了FSHD肌管存在一种细胞自主性的功能缺陷。这种缺陷表现为对电刺激的适应性反应受损，具体包括：无法正常上调肌肉收缩和肌节组织相关基因（如TTN、FHL1），以及无法诱导肌保护性肌因子肌钙蛋白(OSTN)的表达。同时，EPS不仅未能改善FSHD肌管的肌节结构，反而加剧了其紊乱。

研究的关键发现是，DUX4下游的转录因子LEUTX是导致这一缺陷的充分条件。在健康肌管中过表达LEUTX，即使没有DUX4的存在，也足以重现FSHD肌管的所有缺陷表型。这为DUX4基因网络激活如何损害肌细胞功能提供了直接的分子机制证据。

肌钙蛋白(OSTN)诱导的缺陷具有重要的病理生理学意义。最近的研究表明，运动诱导的肌钙蛋白能够抑制纤维-脂肪祖细胞(FAPs)的增殖，并促进凋亡FAPs的清除，从而减少纤维化和脂肪浸润。在FSHD患者和动物模型中，都观察到了FAPs的异常扩增和浸润。因此，FSHD肌管在肌肉使用（运动）过程中无法产生足够的肌钙蛋白，可能为FAPs的异常激活和肌肉的进行性退化创造了条件。

综上所述，本研究将DUX4基因网络激活与FSHD肌管的功能缺陷直接联系起来，揭示了LEUTX介导的肌钙蛋白(OSTN)诱导失败是其中的一个关键环节。这为理解FSHD的病理机制提供了新的视角，并提示针对DUX4下游通路（如LEUTX）或肌钙蛋白信号的治疗策略，可能为FSHD的治疗带来新的希望。