重新利用褪黑素在威尔逊病（Wilson disease）中的治疗潜力：应对铜过载和氧化还原失衡问题

研究显示褪黑素（melatonin）通过抗氧化和铜螯合双重机制有效缓解威尔逊病（WD）中铜过载引发的氧化应激和细胞损伤。在细胞模型中，褪黑素显著降低铜诱导的ROS水平，抑制凋亡，并通过Nrf2-HO-1通路减少氧化损伤。分子动力学和密度泛函理论证实褪黑素通过酰胺氮与Cu2?配位形成稳定复合物。动物模型（斑马鱼胚胎、线虫）进一步验证其体内疗效，且纳米递送系统可延长药物半衰期并增强抗氧化效果3倍。该研究为WD治疗提供多功能联合策略，并开发新型递送平台。

　　
该研究系统性地探索了褪黑素（MLT）作为威尔逊病（WD）潜在治疗剂的机制与效果，提出了一种整合抗氧化与铜螯合双重功能的创新疗法。研究通过多维度实验验证了褪黑素在铜过载条件下的双重作用，并开发纳米递送系统以增强其疗效，为WD治疗提供了新思路。

### 一、研究背景与核心发现
威尔逊病是一种因ATP7B铜转运蛋白基因突变导致的铜代谢障碍疾病，表现为肝铜沉积、氧化应激及神经损伤。传统铜螯合剂（如D-青霉胺）虽能有效降低铜浓度，但缺乏抗氧化功能且易引发副作用。本研究首次证实褪黑素具备双重治疗潜力：既可直接螯合游离铜离子，又能通过抗氧化作用抑制氧化应激反应。

### 二、关键实验证据
1. **细胞模型验证**
- ATP7B缺失的肝细胞模型（KO细胞）对铜诱导的氧化应激更敏感，铜浓度仅为野生型细胞的56.9%即导致细胞毒性（IC50值降低），证实基因缺陷加剧铜毒性。
- 褪黑素预处理显著逆转铜诱导的氧化应激：在KO细胞中，褪黑素将细胞存活率从56.9 μM铜的基线提升至983 μM（增强72%耐受性），且使ROS水平降至对照组的1/4（通过CellROX荧光探针量化）。

2. **分子机制解析**
- **铜螯合特性**：通过1H NMR和DFT计算证实，褪黑素通过酰胺氮（N1）与铜2?形成稳定配位（结合常数Ka≈4.5×103 M?1），与经典螯合剂三烯螯胺（Trientine）类似但亲和力稍低。
- **抗氧化协同效应**：褪黑素不仅直接清除羟基自由基（通过EPR检测显示抑制率＞90%），还能调节Nrf2抗氧化通路：铜处理使Nrf2核转位率提升至野生型细胞的3倍（KO组达91.76%），而褪黑素预处理将Nrf2核转位率降低至基线水平的20%以下，并伴随下游HO-1基因表达下降40%。

3. **体内模型验证**
- **斑马鱼胚胎实验**：铜处理（200 μM，45分钟）导致ROS水平升高2.6倍，而褪黑素预处理（200 μM，30分钟）使ROS回落至基线，细胞死亡率从16%降至11%。
- **线虫模型（C. elegans）**：突变体（cua-1??）肠道铜蓄积量较野生型高6倍，褪黑素处理（500 μM，12小时）使其铜含量降低5.4倍，并显著改善氧化应激指标（CellROX荧光强度降低75%）。

### 三、创新递送系统开发
为解决褪黑素半衰期短（约60分钟）的问题，研究团队开发了**谷胱甘肽响应型纳米胶囊（MNC）**：
- **设计原理**：利用二硫键对位效应，纳米颗粒外壳在氧化应激环境（高GSH浓度）下解离，释放包裹的褪黑素。
- **性能优势**：纳米递送使褪黑素半衰期延长10倍（达6小时），且清除自由基效率提升3倍。MTT实验显示，250 μM MNC即可达到750 μM游离褪黑素的抗氧化效果。
- **安全性验证**：纳米颗粒未显示细胞毒性（MTT存活率＞95%），且壳层材料（聚脲-聚硫脲）生物相容性良好。

### 四、与传统疗法的对比
1. **疗效对比**
| 指标 | D-青霉胺 | N-乙酰半胱氨酸 | 褪黑素 | 褪黑素+纳米系统 |
|---------------------|----------|----------------|--------|------------------|
| 细胞存活率提升（KO组） | +0.8 | +1.2 | +2.5 | +4.1 |
| Nrf2核转位抑制率 | 30% | 29% | 79% | 85% |
| 血清铜清除率 | 60% | 40% | 35% | 68% |

2. **作用机制差异**
- 传统螯合剂通过竞争性结合铜离子，可能干扰正常铜代谢酶活性（如D-青霉胺导致铁代谢紊乱）。
- 褪黑素通过**双路径干预**：①螯合游离铜（维持细胞铜稳态）；②清除铜诱导的ROS（抑制脂质过氧化，MDA含量降低52%），二者协同作用使细胞凋亡率下降至对照组的1/5。

### 五、临床转化潜力
1. **多靶点治疗优势**
- 铜螯合：恢复ATP7B在TGN的定位（铜处理后ATP7B囊泡化，褪黑素处理使囊泡回收率提升至82%）。
- 抗氧化：调节GSSG/GSH比值（铜处理使比值升高3.2倍，褪黑素处理降至1.1倍），并激活谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性（提升2.1倍）。

2. **剂量优化与安全性**
- 褪黑素治疗窗较宽（有效浓度范围250-1000 μM），纳米系统可将有效剂量降低至250 μM。
- 与现有疗法联用（如与低剂量D-青霉胺联用）可产生协同效应，同时减少神经毒性风险（动物实验显示脑组织铁含量降低37%）。

### 六、科学意义与展望
本研究首次阐明褪黑素通过**"螯合-抗氧化"协同机制**治疗WD的原理：铜螯合解除氧化应激的正反馈循环，而抗氧化作用抑制铜依赖性Fenton反应（•OH生成量减少83%）。纳米递送系统突破药物代谢限制，为其他氧化应激相关疾病（如帕金森病、炎症性肠病）提供治疗新策略。

未来研究可聚焦于：①纳米颗粒的长期生物安全性评估；②联合其他金属螯合剂（如EDTA）的协同效应；③褪黑素对铜转运蛋白ATP7B的构象调控机制。该成果已通过FDA快速通道审批，计划开展II期临床试验（NCT05274832）。