DlbHLH66转录因子参与了新鲜龙眼品种‘福源’和‘东碧’在储存过程中果肉酸度的变化

《Powder Technology》：DlbHLH66 transcription factor is involved in the acidity differences in the pulp of fresh longan cv. ‘Fuyan’ and ‘Dongbi’ during storage

龙眼果实贮藏性差异与DlbHLH66调控有机酸代谢机制研究。摘要：通过比较‘Fuyan’（低贮藏性）与‘Dongbi’（高贮藏性）龙眼，鉴定出bHLH转录因子DlbHLH66在果实贮藏期间随劣变进程表达上调，并直接激活SCS、AST、MDH等6个有机酸合成基因，导致‘Fuyan’果肉有机酸积累及品质劣变。电泳迁移率转变实验、双荧光素酶报告基因及染色质免疫共沉淀定量PCR验证其直接调控作用，瞬时过表达DlbHLH66加速果肉降解。该研究揭示了转录因子DlbHLH66通过调控有机酸代谢网络影响龙眼贮藏性的分子机制。

　　
龙眼果实储存品质差异的分子调控机制研究取得突破性进展

摘要部分揭示，龙眼果实贮藏性能与有机酸代谢存在显著关联。研究团队通过比较耐储品种'东璧'与不耐储品种'福圆'的基因表达谱，发现涉及有机酸合成代谢的6个关键基因（DlACL、DlLDH、DlPEPC、DlSCS、DlAST、DlMDH）在'福圆'中表达水平持续高于'东璧'。基于此，研究团队成功鉴定出调控有机酸代谢的新型转录因子DlbHLH66，并证实其在果实劣变过程中起核心调控作用。该研究首次系统揭示了龙眼果实有机酸代谢的分子调控网络，为开发贮藏保鲜技术提供了理论依据。

引言部分系统阐述了龙眼贮藏品质的关键影响因素。研究显示，龙眼贮藏期间有机酸含量显著上升，尤其是琥珀酸、苹果酸和乳酸的积累直接导致果实酸度增加与品质劣变。通过比较两种贮藏性能差异显著的品种，发现有机酸代谢相关酶活性及基因表达水平存在显著差异。前期研究表明，ATP处理可有效抑制有机酸积累，而DNP处理则促进其生成，这为后续转录因子研究奠定了基础。

研究材料与方法部分详细描述了实验设计：选取2022年9月1日采收的'福圆'和'东璧'龙眼果实，在28℃贮藏条件下进行系统取样（0、2、4天）。采用液氮速冻-超低温保存（-80℃）结合RNA提取技术，构建了包含6个有机酸代谢基因的实时荧光定量检测体系。亚细胞定位实验通过免疫荧光和GFP融合蛋白表达技术，确认DlbHLH66主要定位于细胞核，并具备泛核定位特征。

核心研究发现显示：
1. DlbHLH66表达动态与果实劣变进程高度同步。在贮藏第4天时，'福圆'果实DlbHLH66表达量较'东璧'高2.3倍，且与有机酸总含量呈显著正相关（r=0.87，p<0.01）。
2. 该转录因子通过直接结合靶基因启动子区域发挥作用。EMSA实验证实其能与所有6个有机酸代谢基因的启动子DNA形成特异性复合物。ChIP-qPCR验证显示，DlbHLH66在目标基因启动子区域的结合效率达78.6%±2.1%，显著高于随机结合序列（p<0.001）。
3. 瞬时过表达实验表明，外源表达DlbHLH66可使有机酸合成基因（DlPEPC、DlSCS等）的mRNA水平提升1.5-2.8倍，并伴随果肉细胞壁降解加速（SDH活性提高42%）、细胞膜透性增加（电导率提升37%）等劣变特征。

创新性发现体现在：
- 首次在龙眼中发现具有有机酸代谢调控功能的bHLH转录因子
- 构建了从转录调控到代谢产物的完整作用链条（DlbHLH66→有机酸合成基因→酶活性→有机酸积累→品质劣变）
- 揭示了品种特异性调控机制：'福圆'品种的DlbHLH66不仅表达水平更高，其启动子区域CTGA元件（保守转录调控序列）丰度达12.4±0.7个/kb，显著高于'东璧'品种的4.2±0.9个/kb（p<0.001）

该研究突破性地建立了转录因子-DNA互作-代谢通路的三维调控模型。通过比较分析发现，'福圆'品种的有机酸代谢相关基因启动子区域存在特有的bHLH结合位点富集区（每 kb包含4.7个潜在结合位点），而'东璧'品种仅检测到1.2个，这种遗传差异直接导致转录因子活性不同步。研究还发现DlbHLH66通过激活PEP羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（ACL）等关键酶的转录，促进三羧酸循环正向运行，最终导致琥珀酸、苹果酸等有机酸在果肉中异常积累。

在功能验证方面，瞬时过表达实验显示：在果肉发育关键期（贮藏第2天）导入DlbHLH66基因，可使4天内有机酸总含量提升至对照组的2.1倍，同时检测到细胞膜完整性破坏（丙二醛含量增加58%）、线粒体膜电位下降（ΔΨ值降低42%）等典型劣变特征。这为后续研究提供了重要理论支撑，表明该转录因子在果实发育后期可能通过调控能量代谢和膜完整性来影响贮藏性能。

该研究成果在多个层面具有重要应用价值：
1. 品种改良方面，发现'东璧'品种中存在DlbHLH66基因的插入突变（位于启动子区-241至+89区域），导致转录因子活性显著降低。这为通过基因编辑技术改良品种贮藏性能提供了新靶点。
2. 保鲜技术方面，研究证实低温贮藏（25℃）配合0.5% CaCl2溶液处理可有效抑制DlbHLH66表达，其应用可使龙眼货架期延长至7-10天，较传统保鲜方法提升40%。
3. 分子标记开发，基于DlbHLH66基因启动子区域的特异性SNP位点（标记位点：DlHLH66_189），已建立高分辨率分子标记体系，可精准区分龙眼品种的耐储性。

该研究系统揭示了龙眼果实贮藏性能的分子调控网络，特别是发现了bHLH转录因子DlbHLH66在有机酸代谢中的核心作用。研究建立的"转录因子-DNA互作-代谢通路"三维调控模型，为解析其他水果贮藏机理提供了新范式。通过整合转录组、代谢组及酶活性数据，首次绘制出龙眼果实贮藏期间有机酸代谢的全链条图谱，包括PEP羧化（PEPC）、丙酮酸羧化（ACL）、琥珀酸合成（SCS）等关键节点的动态变化。

后续研究方向建议聚焦于：
1. 建立DlbHLH66调控网络的三维可视化模型
2. 探索该转录因子与细胞膜保护相关基因（如MDH、SDH）的互作机制
3. 开发基于DlbHLH66基因编辑的耐储性新品种
4. 研究转录因子调控网络的环境响应特性（如温度、湿度的影响）

这项研究不仅深化了我们对龙眼果实贮藏机理的理解，更为热带水果的分子保鲜技术提供了理论支撑和实践指导。通过解析DlbHLH66的作用机制，研究者成功建立了从基因调控到代谢产物的量化模型，为精准调控果实品质提供了科学依据。特别是在转录因子-靶基因互作层面的创新发现，突破了传统代谢调控研究的技术瓶颈，具有重要的学术价值和产业应用前景。