《Molecular Catalysis》：Stabilization of amano-lipase using freeze-dried inulin–lipase complex
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本研究探究单糖及多糖对冻干脂酶稳定性的影响，发现菊粉-脂酶复合物在有机及水溶液中均保持高活性，经80℃长时间或50℃数周热处理后仍具显著活性，证实其热稳定性与长期储存潜力。
田原良郎|津村亮|松本道明
日本京都府京田边市田原宫谷台1-3，同志社大学化学工程与材料科学系，610-0321
摘要
脂肪酶是一种能够催化独特反应的酶，因其适用于广泛的应用而受到关注。本研究探讨了在冻干过程中添加糖类（包括单糖和多糖）以改善脂肪酶稳定性的方法。在所研究的糖-脂肪酶复合物中，菊粉-脂肪酶复合物在水性和有机溶剂中均表现出相对较高的脂肪酶活性。此外，该复合物在经过热处理（80°C下数小时或50°C下数周）后仍保持较高的残余活性，表明其具有较高的热稳定性，有利于脂肪酶的长期保存。因此，菊粉是一种有前景的脂肪酶稳定剂。
引言
源自自然的生物催化剂对环境影响较小，因其在开发节约资源和非金属催化剂以促进绿色化学方面的潜力而受到关注[1,2]。脂肪酶不仅能在水溶液中催化酯的水解（例如将三酰甘油水解为甘油和脂肪酸），还能在有机溶液中催化酯的合成和酯交换反应。因此，脂肪酶在家庭护理、化妆品、食品、生物柴油和制药等多个领域具有广泛应用前景，值得持续研究[3]。
酶的肽链形成了独特的三维结构，这种结构对其特定功能至关重要。然而，许多酶在溶液中不稳定，并且在纯化、加工、储存和反应过程中容易受到各种因素的影响而发生结构变化，从而导致酶失活。因此，酶在工业应用中的成本往往较高。据报道，向酶中添加糖类可以提高其长期稳定性[[4], [5], [6], [7], [8], [9]]。在水溶液中，蛋白质通常通过与水形成氢键来维持其三维结构。干燥过程中蛋白质变性的一个重要原因是这种水化层的破坏，这会使蛋白质表面的亲水性氨基酸残基暴露出来，从而破坏蛋白质的三维结构。在干燥过程中，糖类可以替代水分并与蛋白质相互作用，防止蛋白质结构展开。糖分子会靠近蛋白质的不规则表面并与之形成氢键，形成玻璃态的无定形结构来稳定蛋白质[10,11]。
本研究开发了一种在冻干过程中将脂肪酶封装在糖类玻璃态结构中的方法，旨在提高脂肪酶的稳定性。具体来说，首先将各种糖类添加到脂肪酶中，然后进行冻干，形成糖-脂肪酶复合物，并在水性和非水性（有机）溶剂中检测这些复合物的活性和热稳定性。虽然添加糖类的主要目的是提高脂肪酶的稳定性，但某些条件还改善了脂肪酶的活性，本文将讨论这种活性的提升原因。
材料
来自Burkholderia cepacia的Amano脂肪酶购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。海藻糖购自Nagase Viita有限公司（日本冈山县）。果糖购自Nacalai Tesque（日本京都）。右旋糖酐、菊粉、三醋酸甘油酯、异辛烷、醋酸乙烯酯、苄醇和苯乙酸酯购自Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。
糖-脂肪酶复合物的制备
如图1a所示，将100 mg/mL的脂肪酶与不同浓度的糖类（10 mg/mL的右旋糖酐、100 mg/mL的果糖或10 mg/mL的海藻糖）混合。
糖-脂肪酶复合物在水溶液中的酶活性
脂肪酶能与海藻糖、果糖、右旋糖酐和菊粉等多种糖类形成复合物。这些单糖和多糖已被证明是有效的蛋白质稳定剂[13]。通过分析三醋酸甘油酯的水解动力学，测定了脂肪酶在水溶液中的活性。图2显示了天然脂肪酶（对照组）、未经处理的冻干脂肪酶（空白组）以及糖-脂肪酶复合物在反应开始时的速率。
总结
在冻干过程中添加糖类可以减轻脂肪酶在水性和有机溶剂中的失活。在菊粉-脂肪酶复合物中，脂肪酶被封装在菊粉的玻璃态结构中，从而保持了其稳定性。与菊粉形成复合物后，脂肪酶在80°C水溶液中的热稳定性得到提高，这有助于脂肪酶的复性。有趣的是，冻干后的脂肪酶在80°C有机溶剂中的热稳定性也较高。
作者贡献声明
田原良郎：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计、资金筹集、数据分析、数据管理。津村亮：数据可视化、结果验证、实验设计、数据分析、数据管理。松本道明：撰写——审稿与编辑、数据可视化、结果验证、实验设计、资金筹集、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
