Plasmid2MC：一种高效无细胞制备高纯度微环DNA用于哺乳动物细胞基因组编辑的新方法

《Communications Biology》：Plasmid2MC: efficient cell-free generation of high-purity minicircle DNA for genome editing in mammalian cells

本研究针对传统质粒在基因组编辑中因含细菌骨架序列导致的细胞毒性、免疫原性和效率低下问题，开发了名为Plasmid2MC的无细胞微环DNA制备新方法。该方法利用ΦC31整合酶介导重组，从常规质粒中高效切除细菌骨架，结合酶切消化和纯化步骤，获得高纯度、低内毒素的微环DNA。实验证明其可用于CRISPR-dCas9碱基编辑和HITI基因组编辑，为基因治疗和基础研究提供了更安全高效的DNA递送工具。

　　

在基因组编辑领域，DNA载体如同精准的"基因快递员"，负责将编辑工具安全送达细胞内部。传统质粒作为最常用的递送载体，却暗藏隐患——其携带的细菌骨架序列（如抗生素抗性基因）如同快递包裹中不必要的"填充物"，不仅增加体积，更可能引发细胞免疫反应、导致基因沉默，甚至影响编辑效率。这好比用带有异味的包装盒运送精致礼品，即便内容物精美，也难获理想效果。微环DNA（minicircle DNA, mcDNA）的出现为解决这一难题带来了曙光，这种去除细菌骨架的环状DNA具有更小的分子量、更高的安全性和更持久的表达特性。然而，现有商业试剂盒依赖专利工程菌进行体内重组，过程繁琐耗时（3-4天）、结果不稳定，且产物常被内毒素和DNA污染物污染，如同一个需要复杂组装却质量堪忧的"DIY套件"。

针对这一瓶颈，哈佛医学院遗传学系的Roman Teo Oliynyk团队在《Communications Biology》上发表了创新性研究成果，开发了名为Plasmid2MC的无细胞制备平台。该方法巧妙利用ΦC31整合酶（一种特性明确的大型丝氨酸重组酶）在试管中完成质粒向微环DNA的转化，摆脱了对活菌的依赖，实现了流程标准化和产物质量的显著提升。

研究团队采用的核心技术方法包括：ΦC31整合酶介导的位点特异性重组反应（在30°C下进行12小时）、蛋白质酶K消化去除整合酶、两次QIAGEN QIAquick离心柱纯化、SspI限制性内切酶切割细菌骨架载体、T5外切酶降解线性DNA污染物。通过系统优化反应条件，并使用HEK293T细胞和小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行CRISPR-dCas9碱基编辑及HITI（同源非依赖性靶向整合）基因组编辑验证。

方法概述

研究设计的Plasmid2MC方法以常规克隆的含attP和attB重组位点的质粒为起点。ΦC31整合酶催化重组反应，将原始质粒分割为两个相互缠绕的DNA环：含细菌骨架的环和目标微环DNA。虽然团队曾尝试简化纯化步骤，但实验表明重组后清理步骤必不可少——首次纯化前需用蛋白质酶K消化去除ΦC31整合酶，确保DNA纯化柱效率；随后用SspI限制性酶切割空细菌骨架质粒，T5外切酶降解所有线性和缺口DNA，最终通过第二次纯化获得高纯度微环DNA。

Plasmid2MC方案在不同ΦC31整合酶和源质粒DNA浓度下的产量

系统测试显示，30°C为重组反应最适温度，产量达38%；反应时间超过8小时后产量趋于稳定（约39.4%）。当质粒DNA浓度固定为100 ng/μl时，微环DNA产量随ΦC31整合酶浓度增加而提升，在100 ng/μl时开始达到平台期。有趣的是，三种测试质粒（大小分别为5758 bp、10418 bp和13942 bp）在最适浓度下微环DNA产量相近（25-30%），表明方法对不同大小质粒均有良好适应性。考虑消化掉的细菌骨架环后，计算得全重组效率分别为54%、50.1%和40%（对应最短、中等和最长质粒）。实验还发现，当每kbp源质粒结合超过5个ΦC31分子时，重组效率达到饱和。

Plasmid2MC方法同步降低内毒素水平

尽管未采用专门的内毒素去除步骤，但方法意外实现了内毒素水平的显著降低。测试表明，源质粒内毒素水平为1.46 EU/μg时，经Plasmid2MC处理后的微环DNA内毒素降至0.042 EU/μg，降幅达35倍。进一步实验证实，内毒素减少主要发生在消化阶段——T5外切酶和限制酶与内毒素结合形成复合物，在纯化洗涤中被去除。相比之下，商业MC-Easy试剂盒制备的微环DNA内毒素水平高达47-121 EU/μg，即使经额外纯化仍保持在14.2-45.8 EU/μg。

微环DNA在HEK293T细胞和mESC中的CRISPR-dCas9碱基编辑应用

为验证制备的微环DNA功能性，团队选用含ef1a启动子、attP/attB位点、杀稻瘟菌素选择标记和dCas9的质粒p-att-ef1a-ABE8e-dCas9-BSD进行测试。测序证实重组后的微环DNA与预期序列完全匹配。同时，采用团队此前开发的环状载体（Circular Vector, CV） protocol快速制备指导RNA（gRNA）表达载体。在HEK293T细胞和小鼠胚胎干细胞中，微环DNA与质粒在介导A→G碱基转换方面表现出相近的编辑效率（约80%），证明其具备完全替代传统质粒的能力。

微环DNA在同源非依赖性靶向整合中的应用

研究还展示了Plasmid2MC在制备HITI兼容微环DNA模板方面的优势。设计的构建体含mKate荧光蛋白序列、潮霉素抗性标记和T2A肽序列，靶向ACTB和GAPDH等看家基因。流式细胞术分析显示，91.6%的ACTB靶向细胞和62.2%的GAPDH靶向细胞成功表达mKate荧光蛋白；PCR进一步证实了微环DNA在基因组位的精确整合。

研究结论部分强调，Plasmid2MC方法的核心优势在于其无细胞操作特性，从根本上避免了传统细菌重组方法的不稳定性和高内毒素污染问题。该方法重组效率接近100%，最终微环DNA产率取决于纯化过程中的损失（针对5.8-13.9 kbp质粒，整体方案效率为34%-56%）。成本分析显示，大规模定制ΦC31整合酶可显著降低单次实验成本，使其具备商业化潜力。与团队此前开发的CV方法（适用于450-950 bp小环状DNA制备）形成互补：Plasmid2MC擅长制备数千碱基的大片段微环DNA，且受益于大肠杆菌克隆扩增，序列准确性极高；CV方法则适合快速制备多个gRNA表达载体。这种"双剑合璧"策略为复杂基因组编辑实验提供了灵活高效的解决方案。

该研究的创新价值不仅在于提供了一种优于商业试剂盒的微环DNA制备方案，更展示了无细胞合成生物学在解决传统生物技术瓶颈方面的巨大潜力。其低内毒素、高纯度的特性使微环DNA更接近临床级应用要求，为基因治疗载体开发奠定了基础。同时，方法模块化的设计思路——即利用特性明确的酶促反应在体外重构复杂生物过程——为其他生物工具的开发提供了可借鉴的范式。