在三维空间中构建适应性免疫系统：利用基质网络和外周血单核细胞创建的患者特异性淋巴细胞模型

本研究构建了基于人脂肪源性干细胞（ADSCs）分化的纤维网状细胞样（FRC-like）三维胶原蛋白模型，通过TNF-α、LT-α和IL-4组合诱导分化为FRC_P1和FRC_P2亚型。该模型成功支持PBMCs与mDCs共培养，促进抗原特异性B细胞激活及IgM抗体分泌，FRC_P1更偏向Th2免疫应答，FRC_P2则增强DC活化和Th1信号。该平台为个性化疫苗筛选和自身免疫疾病研究提供了可扩展系统。

　　
三级淋巴器官（TLOs）是非包裹性免疫系统结构，在慢性炎症或持续感染中形成，能够通过调控局部适应性免疫反应对抗病原体。然而，在体外复现TLOs的复杂性仍面临挑战，尤其是如何构建生理相关的成纤维细胞网状细胞（FRCs）-免疫细胞互作网络。近期一项研究提出了一种基于脂肪来源干细胞（ADSCs）分化的新型3D模型，通过调控细胞外基质（ECM）和免疫微环境，实现了对TLOs功能的高度模拟。

### 1. 研究背景与核心问题
TLOs在肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病研究中具有重要地位。它们通过FRCs分泌多种细胞因子和趋化因子，形成特定的免疫微环境：FDCs支持B细胞分化和抗体生成，而TRCs则调控T细胞激活和迁移。然而，传统2D模型难以模拟TLOs的三维结构和FRCs与免疫细胞的动态互作。现有3D模型虽有所改进，但普遍缺乏以下关键要素：
- **功能多样性FRC亚群**：传统模型中FRCs的异质性常被忽视，而TLOs中不同FRC亚群（如TRCs、FDCs）通过分泌差异化的化学信号调控B细胞和T细胞的分群。
- **动态ECM重塑**：FRCs通过分泌金属蛋白酶降解并重组ECM，这种机械-生化双重调控在TLOs形成中起核心作用，但现有模型难以实现。
- **全血细胞组分**：多数模型仅聚焦特定免疫细胞（如DCs或B细胞），而未整合PBMCs中的异质细胞群体（包括记忆T细胞、浆细胞等）。

### 2. 创新性技术方案
研究团队构建了双亚型FRC-like细胞分化的3D模型：
- **ADSCs定向分化**：通过TNF-α联合LT-α（FRC-P2）或额外添加IL-4（FRC-P1），诱导ADSCs向FRCs分化。其中IL-4的添加显著提升B细胞支持能力，而LT-α的浓度差异则强化T细胞导向功能。
- **三维胶原支架构建**：采用 rat尾I型胶原与戊二醛包被盖玻片复合，形成具有机械张力的纤维网络。该结构在培养48小时内即可形成可收缩的立体支架，其收缩特性与天然TLOs在炎症压力下的重塑行为高度相似。
- **动态免疫微环境模拟**：通过分层共培养策略，将未激活的PBMCs与SARS-CoV-2 S1蛋白激活的mDCs分阶段引入支架，精确模拟TLOs中"抗原呈递-信号放大"的时序关系。

### 3. 关键实验发现
#### 3.1 FRC-like亚群分化特征
- **FRC-P1（IL-4+TNF-α+LT-α）**：
- 表型特征：ICAM1和PDPN高表达，形成中心聚集的FDC样结构，ECM降解率较对照组降低30%
- 功能特性：分泌IL-4（浓度达4676±1913pg/mL）、CXCL13（14.4±7.64pg/mL）和CCL19（9.17±5.2pg/mL），显著促进B细胞增殖和IgM分泌
- 抗原特异性抗体：在共培养15天后，S1蛋白特异性IgM达82.3±21.7μg/mL，较对照组高5.8倍

- **FRC-P2（TNF-α+LT-α）**：
- 形态学特征：α-SMA表达量达FRC-P1的2.3倍，ECM收缩速度加快40%
- 分泌谱：CXCL10（7970±3030pg/mL）和CX3CL1（576±285pg/mL）显著升高，促进Th1细胞浸润
- T细胞激活：IL-2浓度达12.31±11.45pg/mL，CD8+ T细胞耗竭标志物PD1表达量低于FRC-P1组32%

#### 3.2 共培养免疫应答分化
- **B细胞活化**：
- FRC-P1组CD19+ B细胞活度达（89.7±5.2）/10^6 cells，较ADSC共培养组提升2.7倍
- 抗原结合能力：S1蛋白特异性BCR占比达43.2±6.8%（vs PBMC组17.1±4.3%）
- 浆细胞分化：CD138+细胞占比8.7±2.1%（FRC-P1组），较FRC-P2组（4.3±1.2%）高2倍

- **T细胞调控网络**：
- FRC-P2组分泌的CXCL10和CXCL11形成"化学屏障"，将CD8+ T细胞激活率限制在12.3±3.8%
- FRC-P1组通过高浓度IL-4（2555±2364pg/mL）和IL-5（73.9±93.9pg/mL）诱导CD4+ Th2细胞分化，其CD69+记忆T细胞占比达28.4±6.1%
- 双阴性T细胞（CD4-CD8-）在FRC-P1组占比达15.7±4.2%，显著高于FRC-P2组的8.9±2.7%

#### 3.3 3D结构对免疫应答的影响
- **空间约束效应**：当PBMCs与FRCs共培养时，CD45+细胞在支架表面形成的"免疫环"结构使抗体分泌效率提升60%
- **ECM机械信号传导**：
- 胶原纤维密度每增加1μm?1，IL-7分泌量提升18%
- 纤维网络拓扑结构改变可使CXCL12介导的T细胞归巢效率提升40%
- **时间动态特性**：
- 共培养第5天达到免疫应答峰值（IgM 72.3±18.4μg/mL）
- 第10天后出现抗体类别转换（IgG/IgM比值从1:8升至1:3.2）

### 4. 技术优势与转化潜力
#### 4.1 模型特性对比
| 特性 | FRC-P1组 | FRC-P2组 | 传统模型 |
|---------------------|-------------------|-------------------|-------------------|
| ECM收缩率（10天） | 28.5±6.2% | 41.7±8.3% | 15.2±3.8% |
| IgM分泌量（pg/mL） | 14,400±2,850 | 6,820±1,210 | 1,560±420 |
| Th2/Th1比值 | 3.2:1 | 1:2.8 | 1:1.1 |
| PBMC存活率（15天） | 68.3±9.2% | 55.7±11.4% | 42.1±8.7% |

#### 4.2 临床转化路径
- **疫苗评估**：已实现SARS-CoV-2 S1蛋白特异性抗体（IgG 1,250±320pg/mL）的快速筛选，较传统ELISA法缩短培养周期3-5倍
- **autoimmune疾病模型**：通过诱导ADSCs分化为FRC-P2亚型，成功复现类风湿关节炎滑膜微环境（TNF-α 14.0±3.2pg/mL，CXCL10 8,760±1,920pg/mL）
- **个性化治疗**：采用供体来源的ADSCs与PBMCs共培养，在5-7天即可获得HLA匹配的抗体分泌细胞系

#### 4.3 模型局限性
- **信号通路的简化**：未包含BMP/SMAD和Wnt/β-catenin等关键信号轴的调控
- **细胞异质性不足**：FDCs亚群（如CD21+和CD23+）的分化效率仅为天然组织的65%
- **时间跨度限制**：现有15天培养周期仅能观察到初级免疫应答，未涵盖记忆细胞长期驻留特性

### 5. 理论创新点
该研究首次揭示FRCs的分化路径具有"双态调控"特性：
1. **FRC-P1亚型**通过IL-4激活PI3K/Akt通路，促进FDCs相关基因（CD21、PDPN）表达达300-500倍
2. **FRC-P2亚型**依赖LT-α激活NLRP3炎症小体，诱导金属蛋白酶（MMP-9）表达达17倍，实现ECM动态重塑
这种双态分化机制解释了为何单一FRC亚型无法完全复现天然TLOs的免疫调控功能，而组合使用可覆盖80%以上的功能维度。

### 6. 方法学突破
- **3D胶原支架制备**：采用梯度浓度（2-5mg/mL）胶原溶液预形成多孔结构，使细胞渗透率提升至92%
- **细胞共培养系统**：创新性设计"三明治"培养法（FRC层-PBMC层-mDC层），实现免疫细胞在三维空间中的有序迁移
- **动态监测技术**：通过活细胞成像系统（VisiSys V1000）实现72小时连续监测细胞-基质互作，分辨率达1μm3

### 7. 应用前景展望
该模型在以下领域具有突破性应用潜力：
- **疫苗开发**：已成功用于评价mRNA疫苗的抗体应答（IgG titer达1:1200）
- **肿瘤免疫治疗**：在3D模型中可精准调控PD-1/PD-L1信号轴（通过FRC-P1组使T细胞耗竭率降低58%）
- **药物毒性测试**：通过监测ECM重塑速率（每48小时下降率1.2±0.3%），预测药物对TLO结构的损伤效应

该研究不仅建立了首个可动态调控的FRC三维模型，更揭示了细胞外基质机械特性（如弹性模量从2.1kPa增至7.3kPa）与免疫应答的量化关系。这种"结构-功能"双维调控策略为人工免疫器官构建提供了全新范式，预计可使新型抗体药物（如抗PD-1单抗）的优化周期从5年缩短至12个月。