适应性实验室进化优化了工程改造后的磷酸盐利用途径，应用于长形蓝细菌（Synechococcus elongatus PCC 7942）中

《Journal of Biosafety and Biosecurity》：Adaptive laboratory evolution optimizes an engineered phosphite utilization pathway in Synechococcus elongatus PCC 7942

长期传代培养优化了合成生物学改造的蓝细菌Synechococcus elongatus PCC 7942（RH714）的PhoB依赖性磷钴胺代谢能力，通过序列分析发现htxbcde-ptxD基因簇的点突变增强Pt运输活性，同时保持对Pi的特异性吸收，证实长期培养可筛选出高效代谢且生物安全可控的工程菌株。

　　

村上弘树（Hiroki Murakami）| Momokawa Naoki | Motomura Kei | Kuroda Akio | Hirota Ryuichi

日本广岛大学综合生命科学研究生院生物技术系，地址：日本广岛市东广岛区镜山1-3-1，邮编739-8530

合成生物学方法能够创造出适用于各种实际应用场景的微生物底盘，但微生物代谢的改造往往会给其带来代谢负担，这可能促使它们在长期培养过程中发生适应性进化。先前建立的依赖亚磷酸盐（Pt）的代谢系统已被证明是控制转基因微生物的有效手段，尽管该系统的应用会导致微生物生长略微减缓。本研究探讨了长期连续传代培养对Synechococcus elongatus PCC 7942 RH714菌株的影响。与原始菌株RH714相比，经过传代培养的菌株在培养基中的生长速度更快，且对亚磷酸盐的消耗率更高。序列分析显示，引入的htxBCDE转运基因发生了点突变，这些基因是微生物选择性利用亚磷酸盐作为磷源所必需的。将突变基因簇导入S. elongatus PCC 7942后，该菌株重新表现出与传代菌株相同的特性，这表明这些基因变化增强了亚磷酸盐的转运能力，从而解释了观察到的表型现象。在表达突变htxBCDE-ptxD基因簇的菌株中，破坏内源性磷酸盐（Pi）转运基因后，该菌株在含有磷酸盐的培养基中无法生长，这说明转运基因的突变并未改变其对磷酸盐的转运选择性。这些结果表明，长期传代培养培育出了一个能够在亚磷酸盐代谢条件下高效繁殖的突变菌株，同时仍保持了其生物安全特性。

部分内容摘要

蓝细菌的培养条件

Synechococcus elongatus PCC 7942及其衍生菌株通常在改良的BG-11培养基中培养，该培养基含有20 mM的N-三羟甲基甲基-2-氨基乙磺酸/氢氧化钾（pH 8.0，Nacalai Tesque Inc.，日本京都）和35 mM的硝酸钠。培养条件为30°C，光照强度为40 μmol photons m^?2 s^?1，并通过连接在试管上的玻璃适配器以约25 mL/min的速率通入2%的CO₂/空气混合气体。

RH714菌株的特性及传代培养引起的表型变化

先前的研究发现，RH714菌株的生长速度比野生型略慢（参考文献16）。当时并未明确这种生长减缓的原因，但研究人员认为这可能是由于亚磷酸盐氧化导致NAD⁺/NADH比例失衡，或是引入的亚磷酸盐转运蛋白活性较低所致。在最初构建RH714菌株后，我们对该菌株进行了近三年的连续传代培养（详见材料部分）。

CRediT作者贡献声明

村上弘树（Hiroki Murakami）：负责撰写、审稿与编辑工作，以及实验设计与数据整理。Momokawa Naoki：负责撰写、审稿与编辑工作，以及实验方法的设计与数据分析。Motomura Kei：负责撰写、审稿与编辑工作。Kuroda Akio：负责撰写、审稿与编辑工作，以及数据整理。Hirota Ryuichi：负责撰写、审稿与编辑工作，项目监督、资金申请、数据整理以及研究概念的提出。

致谢

本研究得到了日本科学技术机构（JST）的“先进低碳技术研究开发计划（ALCA）”（项目编号：JPMJAL1608）的支持。作者声明不存在任何利益冲突。