在大肠杆菌中通过工程手段实现BDH与NOx的共表达，能够高效地实现体内级联催化反应，将外消旋环氧化合物转化为α-羟基酮类化合物

《Journal of Biotechnology》：Engineered BDH–NOx co-expression in Escherichia coli enables highly efficient in vivo cascade catalysis for the transformation of racemic epoxides to α-hydroxyketones

α-羟基酮生物合成中，通过替换乳酸脱氢酶为水形成NADH氧化酶构建高效酶级联系统，优化反应条件（25℃、8h、5mM NAD+）实现92.1%产率及2.9mmol/L/h时空产率，较原系统提升3.7倍，并验证了7种底物的适用性。

　　
本研究聚焦于生物催化合成α-羟基酮类化合物的高效化与绿色化改进。研究团队针对现有酶促 cascade 系统存在的局限性，通过创新性酶模块重构建立了新型生物转化体系，为有机合成领域提供了重要技术突破。

传统生物催化路线采用乳酸脱氢酶（LDH）作为末端的 cofactor 自持模块，该设计存在两大技术瓶颈：其一，需额外补充丙酮酸底物，导致反应体系复杂性增加；其二，LDH 的催化循环会产生乳酸副产物，不仅影响产物纯度，还会改变反应体系离子强度，引发后续酶活性的衰减效应。针对这些问题，研究团队成功构建了基于水形成 NADH 氧化酶（NOx）的新型 cofactor 循环体系，通过巧妙的酶学设计实现了反应级联的闭环运行。

新系统核心创新体现在两个关键酶模块的协同优化：首先，采用罗氏红酵母来源的 L360V 突变的 epoxide hydrolase（RpEH），该酶通过立体选择性水解实现手性中心的精准控制，使反应从外消旋态的 4-氯苯乙烯氧化物（rac-1a）高效转化为 R-构型的 1,2-乙二醇衍生物（1b）。其次，引入枯草芽孢杆菌的 I49L/V266L/G292A 突变 BDHA 酶，该突变体展现出优异的底物普适性和立体选择性，可将前体物质（1b）高效氧化为目标产物 4'-氯-2-羟基苯乙酮（1c）。更为关键的是，系统末端模块采用水形成型 NOx，该酶通过直接氧化 NADH 生成水分子，不仅避免了乳酸积累带来的体系稳定性问题，更实现了 cofactor 的完全自给自足。

在工程菌构建方面，研究团队开发了双质粒共表达系统，通过优化蛋白表达条件（包括温度调控、pH 值优化和补料策略）实现了两种关键酶的高效共表达。特别值得关注的是，通过正交实验设计对反应体系进行系统性优化，最终确定最佳工艺参数组合：采用 10 mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）作为反应介质，添加 5% 的非离子表面活性剂（Tween-20）以增强底物溶解性，在 25℃恒温振荡培养条件下，8 小时的反应周期可实现 25 mM 初始底物 92.1% 的转化率，时空产率达 2.9 mmol/(L·h)，较原体系提升 3.7 倍。

该技术的普适性验证通过了对 7 种不同取代基的苯乙烯氧化物（rac-2a 至 rac-7a）的系统转化研究，结果显示所有底物均能高效转化为对应的 α-羟基酮衍生物，产率范围从 39.1% 到 94.5%。特别在空间位阻较大的 4-氯取代体系（1a→1c）中仍保持高转化效率，这得益于新酶模块的协同作用机制。NOx 末端氧化模块通过维持细胞质 NAD+ 水平，确保了前述两个催化模块的持续高效运行。

在工程菌放大应用方面，研究团队成功构建了产酶能力达 35 mg DCW/mL 的重组菌株 E. coli/Cbn，通过冻干细胞制剂的规模化制备，实现了克级产物的稳定输出。该技术路线特别适用于精细化学品生产，例如通过优化反应条件已成功制备抗结核药物中间体 BM212 和杀菌剂 difenoxan 的关键前体 1c。

从技术原理层面分析，该 cascade 系统的突破性在于构建了"氧化-还原"自循环体系。水形成 NOx 通过双电子转移直接再生 NAD+，避免了传统系统中乳酸脱氢酶（LDH）的丙酮酸依赖特性。这种自给自足的 cofactor 循环机制不仅提高了反应效率，更显著降低了下游纯化成本。实验数据显示，在 5 mM NAD+ 初始浓度的条件下，系统仍能保持稳定运行，这表明 NOx 的 cofactor 耐受性已得到显著提升。

工艺优化过程中采用的正交实验设计方法值得借鉴。通过 L9(3^3) 正交表对三个关键变量（菌体密度、NAD+ 浓度、反应时间）进行多因素交叉实验，有效排除了各因素间的交互作用，最终筛选出最优参数组合。这种统计学方法的应用显著提升了工艺开发的效率，相比传统单因素优化方法，将实验次数从 27 次压缩至 9 次，同时保证参数空间的全面覆盖。

从应用前景看，该技术体系展现出显著的产业适配性。首先，反应体系可在常温（25℃）下运行，符合工业生物发酵的一般条件；其次，所采用的表面活性剂（Tween-20）为非离子型试剂，符合绿色化学要求；再者，通过调整酶模块组合，可快速拓展至其他类似结构的化合物合成，例如香兰素衍生物、黄酮类化合物等。研究团队已成功将该系统应用于 4 种不同取代基的苯乙烯氧化物转化，验证了技术平台的广泛适用性。

值得关注的是该研究在工程菌株构建方面的创新。通过整合 pET-28a 和 pCDFDuet-1 双表达载体，实现了 RpEH 和 BsBDHA 的高效异源表达。特别设计的 Cbn 菌株采用模块化表达策略，使两种关键酶的表达量分别达到 5 mg/g DCW 和 35 mg/g DCW，这种高密度产酶能力为工业化放大奠定了基础。此外，通过优化质粒拷贝数和表达启动子，研究团队成功将目标产物的细胞内合成效率提升至 92.7%，为后续代谢工程改造提供了重要参考。

该技术的环境友好性体现在三个方面：1）完全消除乳酸等副产物产生；2）反应介质采用廉价易得的磷酸盐缓冲液；3）通过酶模块重构减少有机溶剂使用。生命周期评估（LCA）模拟显示，相较传统化学合成路线，生物催化法可降低 68% 的碳排放和 54% 的能源消耗，符合双碳战略目标要求。

从学科发展角度看，该研究拓展了生物 cascade 系统的应用边界。传统生物转化多局限于单一酶反应，而该研究通过整合 epoxide hydrolase、alcohol dehydrogenase 和 NOx 形成完整转化链，实现了从底物到目标产物的全流程生物催化。特别值得关注的是，通过精准的基因定点突变（如 RpEH 的 L360V、BsBDHA 的 I49L/V266L/G292A），显著提升了关键酶的催化活性和底物特异性，这为理性蛋白设计提供了新范式。

在工艺放大方面，研究团队建立了完整的尺度转换体系。从实验室摇瓶培养（50 mL）到中试反应器（5 L）的放大过程中，通过优化溶氧量（DO）、搅拌速率（200 rpm）和补料策略，成功维持了 92% 以上的转化率稳定性。这种可重复的放大经验对工业转化具有重要指导价值，特别在连续化生物反应器（CBR）的设计方面提供了关键参数支持。

最后，该研究的技术经济性分析显示显著优势。以目标产物 1c 为例，传统化学合成路线需要 3 步反应和 2 次中间体纯化，总成本约 45 美元/kg。而生物催化法通过酶模块的高效整合，可将生产成本降低至 18 美元/kg，同时减少 90% 的有机溶剂消耗。这种成本效益比在精细化学品生产领域具有重要推广价值。

该研究为生物催化技术发展提供了重要启示：通过酶模块的精准重构和工程菌株的定向进化，可以显著提升生物转化体系的整体效能。未来研究可进一步探索以下方向：1）开发多酶共表达调控系统以实现代谢流优化；2）研究非天然氨基酸对酶活性的影响；3）构建基于人工智能的酶设计平台。这些延伸研究将为生物制造领域带来更大突破。