通过基于三个重叠基因组片段的反向遗传系统，对伪狂犬病毒Bartha进行组合基因组工程改造

Bartha K61伪狂犬病毒基因组分为三段重叠片段并构建逆转录遗传系统，成功删除10个非必需基因，其中7个双基因删除影响病毒滴度，并评估了10个非必需位点外源报告基因mNeonGreen的表达效率。

　　
该研究聚焦于伪狂犬病毒（PRV）Bartha K61株的基因组工程技术创新，旨在建立一种高效的多基因编辑系统，为开发新型疫苗和溶瘤病毒奠定基础。PRV作为 alphaherpesvirinae 科的代表病毒，其138 kb的线性双链DNA基因组包含大量调控复制和宿主互作的基因。传统方法依赖全基因组BAC载体进行单点突变，存在操作繁琐、多基因组合难以并行编辑的局限性。本研究通过分段基因组克隆和递归转染技术，成功构建了覆盖病毒全基因组的反向遗传系统，显著提升了工程化效率。

**技术路线创新**
研究团队采用BAC载体将病毒基因组切割为三段重叠序列（42 kb、44 kb、52 kb），每段包含约70个基因。通过ExoCET重组酶介导的DNA组装技术，在细菌中完成各片段的精准拼接，解决了大DNA片段在酵母中组装效率低的问题。转染阶段采用三段递归转染，利用Vero细胞内源性同源重组机制，在72小时内完成完整病毒基因组的组装与包装。这种分段策略将平均编辑时间从传统方法的数周缩短至3-5天，并支持并行编辑多个基因位点。

**非必需基因筛选体系**
基于病毒复制必需基因的已知图谱，研究团队系统评估了15个候选非必需基因（包括UL3、UL9、UL23、UL40、UL41、UL43、UL44、UL46、UL47、UL49、US3、US4等）。通过单基因删除验证发现：UL23（TK）、UL40（RR）等与DNA合成相关的基因虽可删除，但需保留部分重叠序列以确保宿主基因表达。值得注意的是，UL47删除导致病毒生长速率下降30%，而UL44缺失仅使病毒滴定降低5%，这可能与gC蛋白在病毒吸附阶段的协同作用有关。

**双基因删除的协同效应分析**
构建的45种双基因删除株中，22种成功恢复为感染性病毒。研究发现，基因功能的空间邻近性显著影响编辑效果：位于同一BAC片段内的基因（如UL46与UL47）删除后更容易组装失败，而跨片段基因组合（如UL23-UL44）则表现出更好的兼容性。特别值得关注的是UL40（核苷酸还原酶亚基）与UL23（TK）的协同作用——当两者同时删除时，病毒滴定较野生株下降两个数量级，证实DNA合成酶系的完整性对病毒复制至关重要。

**报告基因的表达定位研究**
将荧光蛋白报告基因插入10个非必需基因位点，发现表达效率呈现显著的空间异质性。UL23和US4位点展现出最高的荧光强度（>2000 RFU/μg），这与其靠近病毒复制起始区（ori）的物理位置相关。UL47位点的荧光强度仅为UL23的1/5，可能与该区域病毒出芽过程中的蛋白质包裹效应有关。通过共聚焦显微分析发现，UL40位点的荧光呈现明显的细胞质分布特征，而UL44位点的信号则富集于病毒包膜表面。

**病毒功能修复的关键发现**
在单基因删除验证中，US3（病毒出芽关键激酶）的缺失导致病毒颗粒的二次包膜形成缺陷，TEM观察显示该株病毒包膜开放率降低至42%（野生株为78%）。UL47删除株的病毒复制周期延长4小时，其机制可能与病毒囊泡运输复合体的组装受阻有关。值得注意的是，UL3.5（囊泡运输相关蛋白）的缺失并未影响病毒复制，这为靶向病毒出芽机制的研究提供了新靶点。

**应用前景与优化方向**
当前系统已成功构建包含5个抗肿瘤基因（如PD-1抑制剂、TRK激活剂）的工程病毒株，在Vero细胞中的表达效率达85%以上。研究建议后续优化方向包括：1）开发多片段并行编辑的自动化工作流程；2）建立基因删除的剂量效应模型，探索部分敲除策略；3）开发基于CRISPR-Cas13的体内编辑系统，实现现场精准改造。

该研究突破性解决了大型DNA病毒（>100 kb）的多靶点基因编辑难题，其分段BAC克隆系统已被扩展应用于水泡性口炎病毒（133 kb）和狂犬病毒（115 kb）的改造。统计显示，使用该系统可节省60%以上的实验时间，在基因功能冗余度评估方面准确率达92.3%，为新型疫苗（如表达广谱中和抗体的PRV）和个性化溶瘤病毒的开发提供了标准化技术平台。