血基质和样本制备对血液标志物检测的影响

《Journal of Proteome Research》：Blood Matrices and Sample Preparation Influence Blood Marker Discovery

蛋白质组学分析显示，不同抗凝剂血浆（EDTA、柠檬酸、肝素）及血清样本经五种制备方法（iST、ENRICH-iST、SPEED、perCA沉淀、Mag-Net）处理后，质谱检测的蛋白质组差异显著。EDTA血浆与Mag-Net组合识别率最高（747-1077蛋白组），柠檬酸血浆识别率最低。181个蛋白组在所有条件重叠，揭示样本前处理与基质选择对组学结果的关键影响。

　　
该研究系统评估了不同血液基质类型与样本制备方法对蛋白质组学分析的影响，为临床生物标志物检测提供了关键参数参考。研究包含三个核心发现：第一，血液基质类型显著影响蛋白质检测能力，其中EDTA血浆结合Mag-Net制备法可实现最高蛋白质鉴定数量；第二，样本制备方法对数据完整性和重复性具有决定性作用， bead-based技术（如Mag-Net和ENRICH-iST）在提高检测灵敏度的同时需注意抗凝剂对目标蛋白的干扰；第三，血液样本前处理流程需标准化，特别是离心速度（2315g）和抗凝剂选择（EDTA优于柠檬酸）直接影响实验结果。

实验采用五重交叉设计，选取三种健康志愿者的混合血液样本，涵盖血清（带/不带分离胶）、EDTA血浆、柠檬酸血浆和肝素血浆四种临床常用基质。样本制备方法包括iST（液态处理）、ENRICH-iST（磁珠吸附）、SPEED（TFA酸化）、perCA沉淀和SAX珠富集五种主流技术。质谱分析使用Q Exactive HF-X和timsTOF HT双平台，确保方法学验证的全面性。

关键发现显示：EDTA血浆配合Mag-Net技术可实现平均1077个蛋白群鉴定，显著高于其他组合（如柠檬酸血浆结合SPEED仅359个）。值得注意的是，虽然 bead-based技术（Mag-Net和ENRICH-iST）在蛋白质鉴定数量上占优，但需特别关注肝素血浆中的金属结合蛋白（如铁蛋白）和EDTA血浆中的谷胱甘肽代谢相关蛋白的独特富集现象。这种基质特异性不仅影响目标蛋白的检测量，更改变蛋白质组的表达谱特征。

在方法学比较方面，SPEED流程虽重复性最佳（CV值5.6%-6.8%），但蛋白质鉴定数量仅546-846个，显著低于 bead-based技术。而perCA沉淀法通过选择性去除高丰度蛋白（如纤维蛋白原），成功将低丰度蛋白（如半胱氨酸蛋白）的检测量提升2.3倍。但该方法的组间变异系数高达12.7%，需优化沉淀条件。

仪器性能对结果产生显著影响：timsTOF HT平台检测能力比Q Exactive HF-X高约2.2倍（1100 vs 546蛋白群），特别在检测>2000 Da的中分子量蛋白时优势明显。这提示未来选择质谱设备时需根据目标蛋白分子量范围进行匹配。

临床应用启示方面，研究证实EDTA血浆结合 bead-enrichment技术是检测急性期反应蛋白（如CRP）和凝血因子（如纤维蛋白原）的最佳组合。而柠檬酸血浆因激活凝血酶原抑制物（PCI）导致检测偏差，建议避免用于出血性疾病筛查。血清样本因天然纤维蛋白溶解作用，需配合分离胶使用才能维持稳定（分离胶组较普通血清组蛋白鉴定量提升18%）。

该方法学框架已建立标准化数据库（包含181个重叠蛋白群），为后续生物标志物验证提供基准。特别值得关注的是，Mag-Net技术成功检测到26S蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10，这些蛋白在癌症微环境中表达量可提升3-5倍，为肿瘤标志物开发提供新方向。研究同时发现，离心速度需达到2315g以上才能有效去除血小板残留（残留量降低至0.3%以下），这对临床样本处理流程优化具有重要指导意义。

该研究还存在三点局限：其一，未纳入低温储存（-80℃）对蛋白质构象的影响；其二，抗凝剂浓度梯度设计不足（仅单浓度测试）；其三，样本来源于健康人群，未来需验证方法在疾病状态下的稳定性。建议后续研究可建立动态抗凝剂浓度梯度（0.1-5 mM），并采用单细胞测序技术验证细胞器泄漏假说。

总体而言，研究建立了首个涵盖血液基质与制备方法的标准化蛋白质组分析框架，为FDA批准的生物标志物检测提供了关键参数：最佳组合为EDTA血浆-Mag-Net bead-enrichment，可同时满足高灵敏度（>1000蛋白群）和重复性（CV<15%）需求。这一发现将显著提升临床蛋白质组学检测的标准化水平，缩短新标志物从发现到临床转化的周期。