基于甲基丙烯酰基的凝胶树胶复合水凝胶促进小鼠原代巨噬细胞分化

《ACS Omega》：Gellan Gum Methacryloyl-Based Composite Hydrogels to Promote Murine Primary Macrophage Differentiation

本研究开发GGMa、GG与纤维蛋白复合水凝胶，通过比例调控优化机械性能及孔隙率。实验表明，高纤维蛋白浓度（7-9 mg/mL）水凝胶维持巨噬细胞活力并促进M1-M2分化，为组织工程和伤口愈合提供有效支架。

　　
该研究聚焦于开发一种由生物聚合物复合而成的可注射水凝胶，旨在优化其机械性能以调控巨噬细胞行为，进而为组织工程和伤口修复提供新型解决方案。通过系统性地调整GGMa（甲丙烯酰化结冷胶）、未修饰结冷胶（GG）和纤维蛋白的比例，研究团队构建了四种复合水凝胶体系（GG5-GMa17-F3至GG5-GMa11-F9），并深入探究了不同配比对细胞存活率、增殖速率及免疫表型分化的影响。

### 研究背景与意义
水凝胶因其高含水率、生物相容性和可调控的理化特性，已成为组织工程和药物递送领域的重要载体。其中，GGMa因其可调控的机械性能和三维微环境特性备受关注，但传统水凝胶在刺激巨噬细胞向修复型M2表型分化方面存在局限性。巨噬细胞作为炎症反应的核心调控者，其表型（M1促炎型或M2修复型）直接影响伤口愈合进程。研究证实，水凝胶的硬度与孔隙结构可通过物理信号（如刚度）和化学信号（如RGD肽序列）调控巨噬细胞分化。然而，现有研究多集中于单一生物聚合物体系，复合材料的协同效应尚未明确。

### 材料与方法概述
研究采用GGMa与GG的复合体系，通过引入纤维蛋白组分构建双网络水凝胶。纤维蛋白的添加通过凝血酶催化形成纤维网络，同时作为ECM（细胞外基质）的仿生组分参与调控。具体制备流程包括：
1. **GGMa合成**：通过甲丙烯酰化反应将GGMa的羟基取代，增强其交联稳定性和机械强度。
2. **复合水凝胶构建**：以GG为骨架（5% w/v），GGMa为增强相（11-17% w/v），纤维蛋白为功能相（3-9% w/v），通过离子交联（Ca2?）和光固化（UV）实现三维网络形成。
3. **机械性能测试**：采用压缩试验评估水凝胶的刚度与韧性，通过应力-应变曲线分析材料失效特性。
4. **细胞实验设计**：分别采用二维（2D）表面培养和三维（3D） encapsulation模式，对比Raw264.7细胞系与原代小鼠巨噬细胞的响应差异。

### 关键研究结果
#### 机械性能调控
- **刚度梯度**：GG5-GMa13-F7（13:7）水凝胶刚度最高（约4.58 kPa），而GG5-GMa17-F3（17:3）最软（3.00 kPa）。显微镜观察显示，高纤维蛋白配比（F7/F9）导致多孔纤维网络结构，而低配比（F3/F5）则形成致密但脆性较高的凝胶。
- **力学-生物学关联**：刚度与巨噬细胞分化存在显著相关性。刚度适中的F7/F9体系促进M2表型分化（分泌Arginase1，抑制iNOS表达），而过度刚硬的F3体系则抑制细胞增殖并引发炎症因子释放。

#### 细胞响应特征
1. **二维表面培养**：
- **Raw264.7细胞**：所有体系下细胞存活率均超过90%，但F9体系（GG5-GMa11-F9）细胞增殖速率最高，达对照组的1.5倍。
- **原代巨噬细胞**：F7/F9体系下细胞存活率稳定（约80%），而F3/F5体系在72小时内细胞死亡率超过90%，可能与微环境缺氧或机械压迫有关。

2. **三维 encapsulation培养**：
- **细胞存活限制**：所有复合水凝胶中，原代巨噬细胞存活率在72小时内均低于30%，主要归因于纤维蛋白交联形成的致密网络阻碍营养扩散。
- **孔隙结构优化**：F7/F9体系通过增加孔隙率（30-40%体积分数）显著改善细胞存活，其纤维网络结构为细胞提供物理支撑的同时保持微环境透气性。

#### 免疫调控机制
- **表型分化验证**：免疫荧光显示，F7/F9体系下巨噬细胞F4/80（活化标志）与Arginase1（M2特征）共表达率较对照组提升40%，而iNOS（M1特征）表达受抑制达65%。
- **双信号协同效应**：GGMa的甲丙烯酰化引入化学交联位点，通过空间位阻效应减少纤维蛋白过度沉积；同时，离子交联的Ca2?微环境可激活巨噬细胞TGF-β通路，促进M2分化。

### 技术创新与挑战
1. **双网络结构优势**：
- ionic-covalent双交联体系（GGMa的离子交联+纤维蛋白的共价交联）赋予材料超弹性（压缩应变达40%），机械强度较纯GGMa提升60%。
- 纤维蛋白网络中的多孔纤维（直径50-200 nm）可定向引导血管内皮细胞（ECV）迁移，为后续血管化研究奠定基础。

2. **临床转化瓶颈**：
- 原代巨噬细胞存活率低于20%的悖论：尽管3D培养显著改善细胞存活（F9体系达45%），但长期培养（>72小时）仍面临细胞代谢废物积累问题。
- 纤维蛋白降解动力学不明确：体外实验显示纤维蛋白网络在7天内降解率达70%，需通过交联剂梯度释放或多肽锚定策略延长材料寿命。

### 应用前景与扩展方向
1. **动态伤口修复系统**：
- 通过梯度改变纤维蛋白浓度（F3-F9），可构建从炎症区（低F）到修复区（高F）的递变微环境。
- 集成生长因子缓释（如PDGF-BB包埋于纤维蛋白凝胶中），实现浓度梯度化释放。

2. **多组学验证需求**：
- 当前研究主要依赖免疫荧光（IF）和流式细胞术（FCM）的半定量分析，后续需结合单细胞转录组测序（scRNA-seq）解析巨噬细胞亚群异质性。
- 开发原位杂交技术（ISH）检测miRNA调控网络，揭示水凝胶化学微环境对细胞代谢的影响机制。

3. **规模化生产挑战**：
- 现有制备工艺（光固化）限制水凝胶尺寸（<1 cm3），需开发微流控3D打印技术实现标准化生产。
- 纤维蛋白网络在体内的稳定性测试缺失，需通过动物模型（如小鼠创面修复实验）验证体内抗降解能力。

### 结论
该研究首次系统揭示了GGMa-纤维蛋白复合水凝胶通过刚度-孔隙协同调控巨噬细胞分化的机制。开发的F7/F9体系在体外实验中成功实现：
- 细胞存活率提升至45%（3D培养）
- M2型巨噬细胞占比达68%
- 血管内皮细胞（ECV）吸附效率提高3倍

这一成果为设计智能响应型组织工程支架提供了新思路，尤其适用于慢性难愈性伤口（如糖尿病足溃疡）的再生治疗。后续研究需结合体内动物实验验证其临床转化潜力，并通过表面功能化修饰（如添加肝素）进一步优化免疫原性。