时间分辨转录组分析揭示海枣应对Fusarium proliferatum诱发猝倒综合征的分子签名与防御机制

《Journal of Experimental Botany》：Time-resolved Transcriptome Analysis Reveals Molecular Signatures of Fusarium proliferatum DSM106835-induced sudden decline syndrome in Date Palm (Phoenix dactylifera L.)

本研究针对由Fusarium proliferatum DSM106835（Fp）引起的海枣猝倒综合征（SDS），通过时间序列RNA-Seq分析，系统解析了海枣根和茎在4、8、16 dpi的动态转录组响应。研究发现Fp侵染激活了PTI、ETI、MAPK信号通路、ROS爆发、细胞壁重塑以及JA、ET、SA、ABA等多种激素信号转导，并重编程了初级和次级代谢。WGCNA分析进一步揭示了组织特异性防御模块和枢纽基因。该研究为阐明海枣抗Fp分子机制提供了新见解，并为抗病育种提供了关键靶点。

　　

在干旱和半干旱地区，尤其是中东和北非，海枣（Phoenix dactylifera L.）不仅是一种关键的经济作物，更在粮食安全和生态稳定中扮演着不可或缺的角色。其果实——椰枣，富含必需的碳水化合物、纤维、矿物质和抗氧化剂，是当地居民重要的营养来源。尽管海枣天生具有适应恶劣沙漠条件的能力，但要获得理想产量，仍然需要精心的管理和灌溉。在阿拉伯联合酋长国（UAE），海枣具有极其重要的农业和文化价值。然而，气候变化和真菌病原体的侵袭，特别是富士克镰刀菌复合群（Fusarium fujikuroi species complex, FFSC）中的成员，正严重威胁着海枣的生产。其中，增殖镰刀菌（Fusarium proliferatum, Fp）是导致猝倒综合征（Sudden Decline Syndrome, SDS）的主要元凶，这是一种毁灭性的病害，其特征是根腐、萎蔫，并造成巨大的经济损失。

SDS是一种复杂的土传病害，可由多种病原体引起。在阿联酋，茄病镰刀菌（F. solani）、增殖镰刀菌（F. proliferatum）和尖孢镰刀菌（F. oxysporum）被证实是最具攻击性的SDS病原体，而近年来，F. proliferatum有成为优势菌种的趋势。尽管存在一些农艺和化学手段来管理SDS，但由于在海枣中尚未鉴定出明确的抗病基因，限制了有效防控策略的开发。可持续的方法，例如利用根际和内生放线菌等生物防治剂（BCAs）来对抗镰刀菌，提供了环境友好的替代方案。深入理解植物与病原体相互作用的分子机制，是获得长期抗性的关键。转录组学能够解读宿主对病原体的分子响应，而时间序列转录组分析可以捕捉动态的防御过程，这对于阐明SDS的分子机制、鉴定抗病相关基因以及筛选抗病品种至关重要。

植物拥有一套多层次免疫系统。它起始于模式触发免疫（Pattern-Triggered Immunity, PTI），由病原体相关分子模式（PAMPs）激活；以及效应子触发免疫（Effector-Triggered Immunity, ETI），由特定的病原体效应子触发。这些信号级联反应会引发一系列防御响应，包括细胞壁强化、活性氧（ROS）爆发，以及由水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和脱落酸（ABA）等植物激素介导的广泛的转录重编程。这些激素通常与MYB、NAC、ERF和WRKY等关键转录因子（TFs）相互作用，以精细调控防御反应。通常，SA介导对活体营养型病原体的抗性，而JA和ET在防御死体营养型病原体中发挥核心作用。此外，木质素（强化细胞壁）、类黄酮和酚类（具有抗真菌特性）等次生代谢物也通过加固细胞壁和直接抑制真菌生长来贡献于植物防御。

本研究旨在揭示海枣应对Fp侵染的复杂转录组响应。研究人员通过时间序列转录组分析，系统描绘了海枣在病原菌侵染过程中的动态防御网络，为理解其抗病机制和开发新型防控策略奠定了坚实基础。相关研究成果发表在植物科学领域知名期刊《Journal of Experimental Botany》上。

为开展本研究，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，从表现SDS症状的海枣树中分离并鉴定了F. proliferatum菌株DSM106835。使用六个月大的‘Barhee’品种海枣组培苗，在根系接种Fp分生孢子悬浮液后，于4、8和16天（dpi）分别收取根和茎组织样品，每个时间点设置三个生物学重复。随后，利用DNBSEQ-G400平台进行高通量RNA测序（RNA-seq）。对获得的序列数据进行质控、比对至海枣参考基因组并进行转录本定量。差异表达基因（DEGs）分析使用DESeq2软件完成。此外，还进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以揭示显著变化的生物学过程和通路。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与性状相关的基因模块和枢纽基因。最后，通过实时定量PCR（qRT-PCR）对部分关键DEGs的表达谱进行了验证。本研究队列的样本来源于阿联酋Al Wathba Marionnet LLC组织培养设施。

感染与病害进程

研究人员首先评估了海枣幼苗接种Fp后的病害发展过程。在接种后4天（4 dpi），幼苗几乎没有可见症状，处于无症状期。到8 dpi时，叶片开始出现萎蔫，标志着可见SDS症状的开始。至16 dpi，萎蔫加剧并出现明显的根萎缩。病害严重度指数（DSI）和分生孢子计数均显示病害严重度稳步上升直至16 dpi。qRT-PCR分析也证实了真菌生物量从4 dpi到16 dpi在根和茎组织中均显著增加。基于这些发现，研究选择4、8和16 dpi作为关键时间点进行转录组分析，以捕捉病害的早期、过渡期和晚期阶段。

差异表达基因的鉴定

转录组分析结果显示，随着感染时间的推移，根和茎组织中差异表达基因（DEG）的数量均呈现渐进式增加，且在直接受侵染的根组织中反应更为显著。具体而言，根中上调基因数在4、8、16 dpi分别为2,897、10,670和12,717个，下调基因数分别为2,403、4,781和8,689个。茎中的DEG数量较少，但趋势相似。主成分分析（PCA）显示各重复间差异小，而不同处理间分离明显，表明接种引发了显著的转录重编程。基因表达热图也反映了明显的组织特异性变化。

基因本体（GO）分析

GO富集分析揭示了DEGs分子功能的时间性变化。在根组织中，早期响应（4 dpi）富集于免疫信号和结构强化相关条目，如“对化学物质的响应”、“细胞壁组织”和“DNA结合转录因子活性”。到8 dpi，富集条目转向“RNA修饰”和“转录调控活性”。至16 dpi，富集转向“蛋白酶体复合物”和“肽酶复合物”等蛋白水解相关组分，提示在长期胁迫下细胞向降解过程过渡。在茎组织中，早期富集条目与光合作用干扰相关，如“光系统I”和“光合作用-光捕获”，同时“脱落酸激活的信号通路”也显着富集，表明ABA在系统信号中起作用。这种干扰在8 dpi持续，并伴随有机酸代谢的启动。到16 dpi，尽管质体特异性条目富集不再明显，但表达模式 largely 持续。

KEGG通路分析

KEGG通路分析识别了显著改变的生物学通路。在根部，4 dpi时即观察到防御相关通路的强烈激活，包括植物激素信号转导（94个基因）、植物-病原体互作（55个基因）、MAPK信号通路（42个基因）和苯丙烷类生物合成（40个基因）。8 dpi时，根部维持强烈的防御响应，并新增了ABC转运蛋白通路（48个基因）的富集。到16 dpi，防御相关富集显著下降，仅蛋白酶体相关基因显着富集。在茎部，早期响应（4 dpi）涉及生物碱（10个基因）和类黄酮（22个基因）生物合成等次生代谢的激活。8 dpi时，茎部防御增强，富集于植物-病原体互作（112个基因）和MAPK信号通路（72个基因），而卟啉和叶绿素代谢（36和23个基因）的富集表明光合作用持续受损。至16 dpi，碳代谢（144个基因）和乙醛酸/二羧酸代谢（43个基因）的富集表明向能量生成的代谢重编程，MAPK信号通路中仍有63个基因富集，提示防御活动持续。

对Fp感染的多层免疫响应

多层免疫响应明显，尤其在MAPK信号通路中，跨时间点共鉴定出163个DEGs。病原体PAMP flg22被FLS2受体识别后，启动了MAPK级联反应，涉及MAPKKKs的持续激活。下游MPK4激活WRKY33，而MPK3诱导ACS6以增强ET产生，并激活WRKY29。此外，系统性的氧化爆发（由H₂O₂积累标记）在根（4 dpi）和茎（所有时间点）中均被检测到，由MKK4/5和NDPK2激活介导，通过OXII上调并经由MPK3/6磷酸化增强WRKY29表达，形成正反馈环路强化早期免疫。植物-病原体互作通路中，关键的病原体识别受体CERK1显著上调。

Fp感染对代谢通路的影响

对激素生物合成关键通路的转录变化分析显示，半胱氨酸和蛋氨酸代谢（ET相关）中，ACS和ACO等ET生物合成关键酶在根中高度上调。α-亚麻酸代谢（JA相关）通路中，将OPC8转化为JA的酶在茎中上调更明显，表明JA调控具有组织特异性。苯丙氨酸代谢（SA前体合成）中，关键的苯丙氨酸解氨酶（PAL）在根中4和8 dpi被诱导，并在茎中保持较高水平。色氨酸代谢（IAA相关）中，将色胺转化为IAA的酶普遍上调。类胡萝卜素生物合成（ABA相关）通路中，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（ABA前体合成关键酶）上调，而ABA分解代谢酶ABA 8‘-羟化酶也在两种组织中上调，表明ABA动态调控。

激素信号转导动力学

对主要激素信号通路的转录调控分析显示，大量激素相关基因差异表达，呈现动态和组织特异性调控。在根中，AUX信号表现为AUX1持续上调但ARF下调。CK信号在早期被抑制，后期部分组分上调。GA信号涉及DELLA抑制子的持续上调。ABA信号在4 dpi通过PYR/PYL和SnRK2上调启动，后期PP2C上调可能减弱反应。ET信号被强烈激活，ET受体、EIN2、EIN3和ERF1/2等持续上调。BR信号在根中启动但在茎中被抑制。JA信号中JAZ抑制子上调，而关键激活子MYC2仅在根中8和16 dpi上调。SA信号中NPR1在根中持续上调但在茎中下调，下游TGA因子被广泛诱导。

主要激酶和TF家族的鉴定

激酶家族分析显示激酶介导的信号传导随时间逐步升级，共鉴定到3,644个显著差异表达的激酶基因。根组织总体反应更强。RLK-Pelle_DLSV和RLK-Pelle_LRR-LEC是代表最多的激酶家族。TF分析共鉴定到2,657个差异表达的TFs，其中上调占主导（72.3%）。ERF、bHLH、MYB和WRKY是代表最多的TF家族，许多成员显着上调。

WGCNA识别关键基因模块

WGCNA分析揭示了10个有生物学意义的基因模块。蓝色模块与组织类型呈强负相关，代表根特异性表达基因。黄色模块与组织类型呈强正相关，指向茎特异性表达基因。紫色模块与处理（感染）呈强负相关，表明该模块基因在感染后被显著抑制。红色模块与处理呈强正相关，其基因在响应Fp感染时广泛上调。粉色模块与组织和处理均呈正相关，暗示其基因主要在茎组织中表达并在感染后进一步诱导，突出了茎特异性防御响应。青绿色模块与处理正相关、与组织负相关，提示根特异性转录响应。

qRT-PCR验证

通过qRT-PCR对选择的参与防御和激素信号的关键DEGs进行验证，其表达趋势与RNA-seq分析结果高度一致，证实了RNA-seq数据的可靠性。

本研究通过时间分辨转录组分析，深入揭示了海枣应对Fp侵染的复杂分子机制。结果表明，海枣采用了一种潜在的协调防御策略，涉及信号级联、激素调控和代谢重编程。研究将观察到的激素交叉对话和关键通路激活整合到植物免疫的“zig-zag”模型中，阐释了从PTI到ETI的防御升级过程。早期由PRR识别PAMP触发的PTI反应，以及伴随的ROS爆发、细胞壁强化和苯丙烷类通路激活，构成了第一道防线。随着病原菌 colonization 的进展，更强烈、持久的ETI反应被激活，并由SA、JA/ET等激素信号精细调控，形成了韧性的防御系统。与其它一年生单子叶植物相比，海枣表现出延长的ABA和蛋白水解信号激活，反映了其作为多年生植物在长期病原压力下的适应策略。WGCNA分析进一步揭示了组织特异性的防御模块和枢纽基因，例如根中富集于病原识别和免疫信号的模块，以及茎中与光合作用和系统胁迫适应相关的模块。这些发现不仅揭示了海枣抗Fp的分子基础，为通过靶向育种或生物技术干预（如增强PTI/ETI组分、聚合R基因、调控关键TF和激素通路）来提高海枣对SDS的抗性提供了宝贵的基因资源和理论依据，也对理解其他多年生作物应对土传病害的防御机制具有重要参考价值。