在法国南部诊断出的人类冠状病毒NL63的基因组序列

本研究2021年从法国收集17例HCoV-NL63基因组，采用自研多重PCR结合Illumina测序，发现16例属C2亚型、1例B1亚型，与GenBank已有序列相似度达90.5%-98.3%，并揭示I507L突变普遍存在于C2亚型，提示持续监测该病毒多样性与进化。

　　
人类冠状病毒NL63的基因组特征与进化分析（基于法国2021年样本的序列研究）

一、病毒背景与流行病学特征
人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63）自2003年被发现以来，已成为全球呼吸道疾病监测的重要对象。该病毒属于α冠状病毒属，其单链正链RNA基因组约28kb，编码16种非结构蛋白、4种结构蛋白（刺突蛋白、包膜蛋白、基质蛋白、核衣壳蛋白）和1种 accessory蛋白。病毒通过ACE2受体进入宿主细胞，主要感染儿童群体，症状从轻微呼吸道感染到危及生命的重症不等。

全球监测数据显示，HCoV-NL63自2020年以来呈现活跃流行态势。截至研究发表时（2025年7月），GenBank已收录345个基因组序列，其中24%的样本采集于2020年后。地理分布显示美国（31%）、英国（28%）、中国（21%）为主要流行区域。病毒进化过程中已分化出3个主基因组（A、B、C）和8个亚型，本研究首次在法国境内检测到B1亚型病毒，同时确认C2亚型在当地的主导地位。

二、研究方法与样本特征
研究团队采用标准化分子诊断流程：首先使用自建的多重PCR系统进行病毒基因组富集，该系统包含35对特异性引物（经GEMI软件优化设计），覆盖病毒基因组主要编码区。随后通过SuperScript III反转录酶进行RT-PCR扩增，采用Illumina NovaSeq平台进行测序（2×250bp双端测序），平均数据量达735万 reads（范围264万-1787万 reads）。通过Genome Detective平台完成数据预处理（去除低质量reads和接头序列），最后采用默认参数进行基因组组装与注释。

样本来源于2021年法国南部地区呼吸道样本残留物，经多重实时荧光PCR检测确认为HCoV-NL63阳性。所有样本均通过MagMAX病毒核酸提取系统进行RNA纯化，确保核酸质量符合测序要求。测序深度平均覆盖率达98%（90-99%），特别在5'和3'端存在扩增盲区，这与多重PCR的扩增策略相关。

三、核心研究结论
1. 基因组特征分析
研究获得17个独立基因组序列，长度27,322-27,465bp，与NC_005831.2参考序列相比，平均覆盖率98.0%。通过系统发育树重建（使用MAFFT对齐和IQ-TREE最大似然分析），确认16例样本属于C2亚型，1例为B1亚型。C2亚型内平均序列相似度达98.3%，与B1亚型的相似度仅为90.5%。

2. 关键进化特征
（1）刺突蛋白关键位点的变异：所有C2亚型样本均携带I507L突变，该位点位于病毒与宿主ACE2受体的结合域，实验证据显示该突变可能增强病毒宿主细胞结合能力。而B1亚型未检测到该突变，提示存在不同的进化路径。

（2）地理进化关联性：系统发育分析显示，法国分离株与2017-2024年间美国（31%）、日本（8%）、英国（28%）、中国（21%）及瑞士（12%）的样本形成紧密进化分支。其中与2020年后美国分离株的序列相似度达97.3%，显示该病毒在欧美亚地区存在持续传播。

（3）亚型分布格局：C2亚型占研究样本的94.1%，与GenBank现有数据中该亚型占比（约65%）形成对比，表明法国可能存在局部亚型聚集现象。B1亚型的发现补充了该病毒进化树中的多样性分支。

四、流行病学意义与防控启示
1. 病毒多样性监测：研究显示法国自2021年以来HCoV-NL63的流行株以C2亚型为主，但存在B1亚型共存现象。这与全球范围内亚型分布不均衡（美国以C1亚型为主，中国偏好C2亚型）形成对比，提示法国南部地区可能存在独特的病毒进化环境。

2. 诊断技术优化：自建的多重PCR系统展现出高效性，35对引物设计覆盖了病毒基因组的82%区域，既保证扩增效率又减少假阳性。测序深度与完整度达到当前 NL63 研究的平均水平（文献报道覆盖率92-98%）。

3. 突变监测与公共卫生：I507L突变的普遍存在提示可能需要更新现有诊断试剂的靶标区域。研究同时发现C2亚型内部存在2.7%的碱基差异（基于17例样本的比对分析），这为疫苗设计提供了新的靶标选择。

五、研究局限性及未来方向
当前研究存在三方面局限：首先样本采集集中于2021年单一时间点，未能反映季节性波动；其次测序深度对低丰度基因（如accessory蛋白）检测存在瓶颈；最后缺乏临床数据关联分析。建议后续研究应建立：
（1）动态监测网络：覆盖全年多地区样本采集
（2）深度测序方案：针对10kb以下基因组的完整测序
（3）功能验证实验：重点考察I507L突变对病毒传播能力的影响

本研究证实法国南部地区HCoV-NL63的流行亚型与全球趋势存在差异，特别是在B1亚型的检测上填补了区域数据空白。这为欧洲大陆的病毒监测提供了新的参考标准，同时提示需要建立更精细的亚型分类体系，以适应未来可能出现的新变异株。