两种抗甲病毒双特异性单结构域抗体的体内疗效验证、冷冻电镜（cryo-EM）表位鉴定及其作用范围研究

《Journal of Virology》：Demonstration of in vivo efficacy, cryo-EM-epitope identification, and breadth of two anti-alphavirus bispecific single domain antibodies

本研究开发了两款双价单域抗体（sdAb），CA-abd和BA-abd，可有效保护小鼠免受委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）多种亚型及气溶胶暴露的致病作用。通过冷冻电镜解析了sdAb与病毒包膜蛋白的复合结构，发现其结合保守区域并阻止病毒膜融合。实验证实CA-abd对VEEV的交叉保护效果更广，并能中和多种 alphaviridae 病毒，提示其作为广谱抗病毒疗法的潜力。中文摘要：开发双价单域抗体（sdAb）CA-abd和BA-abd，通过冷冻电镜解析其与VEEV包膜蛋白结合结构，证实对多种VEEV亚型及气溶胶暴露的防护效果，其中CA-abd显示更广谱的中和能力，为潜在广谱抗 alphaviridae 疗法提供依据。

　　
委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）是一种通过蚊虫传播的阿拉夫拉病毒属（Alphavirus）成员，其引发的脑炎在动物和人类中均可能导致高死亡率。尽管VEEV自20世纪70年代起被用作生物威胁剂，但至今仍缺乏FDA批准的疫苗或特效疗法。近年来，单域抗体（sdAb）因其独特的优势成为抗病毒治疗的研究热点。这类仅含重链可变区的纳米抗体具有小分子特性，可穿透组织屏障，且不易引发免疫反应。2023年的一项重要研究通过构建双价sdAb，在体外和体内实验中验证了其对抗VEEV及多种阿拉夫拉病毒的多价效应对策。

### 研究背景与科学意义
阿拉夫拉病毒属包含引发脑炎（如VEEV、西尼罗河病毒、 Eastern equine encephalitis virus）和关节炎（如基孔肯雅病毒）的多个血清型。VEEV的IAB和IC亚型具有高度致病性，其中IC亚型近年多次引发美洲国家疫情。当前，仅有的VEEV特异性抗体仍处于实验阶段，且缺乏针对不同亚型的广谱解决方案。单域抗体因分子量小（15-30 kDa）、稳定性高且可通过融合模块延长半衰期，成为理想的抗病毒载体。

### 关键技术突破与实验设计
研究团队采用双价sdAb技术，将两种独立识别病毒表位的sdAb通过可调控的连接肽结合，形成空间协同的复合物。具体策略包括：
1. **结构优化**：通过冷冻电镜解析sdAb与病毒包膜蛋白的复合结构，揭示V2B3、V2C3和V3A8f三个单抗的识别位点。其中，V2B3结合E1-E2界面，V2C3锁定融合肽区域，V3A8f覆盖E2保守区，形成立体互补的防护网络。
2. **半衰期工程**：将单抗与细胞外基质结合蛋白（如牛血清白蛋白结合域）融合，实验显示血清半衰期延长至29小时以上，显著提升生物利用度。
3. **多亚型验证**：采用SC（皮下）和AE（气溶胶）两种暴露模型，测试了VEEV IAB、IC、ID等亚型及不同传播途径的防护效果。气溶胶挑战模拟生物威胁场景，显示双价抗体对IAB亚型有80%保护率，但对IC亚型存在一定局限性。

### 核心发现
1. **广谱中和能力**：
- CA双价抗体（V2C3-V3A8f）对VEEV IAB、IC、ID亚型均表现出高效中和（PRNT80达0.049-0.781 μg/mL），其中对IAB亚型的抑制效果尤为显著。
- 跨病毒中和：CA-Abd对西尼罗河病毒（EEEV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）等阿拉夫拉病毒的中和效价提高3-5倍，BA双价抗体（V2B3-V3A8f）对部分亚型（如EEEV IIIA）存在中和盲区。

2. **立体构象协同效应**：
- 结构模拟显示，V2B3和V2C3的抗原结合位点在病毒包膜表面呈非重叠分布，而V3A8f的识别区域位于两者之间，形成三维网状覆盖。这种设计避免了单抗结合位点的空间重叠，确保多表位协同阻断病毒入侵。
- 例如，V2C3通过结合E1-E2融合界面，直接干扰病毒与宿主细胞膜的结合；V3A8f通过靶向E2蛋白的保守区段，抑制病毒颗粒的聚集成团。

3. **体内疗效验证**：
- SC暴露实验中，双价抗体对IAB和ID亚型均实现100%生存率，且临床评分显著优于阴性对照组（P<0.005）。
- 气溶胶暴露实验显示，对IAB亚型（TrD毒株）的保护率达80%，但对IC亚型（INH-9813）的致死率抑制效果较弱（仅降低3.5天）。研究推测这与其E2蛋白的氨基酸差异（IC亚型E2存在关键抗原表位突变）相关。

### 理论创新与实践价值
1. **多价抗体的协同机制**：
- 研究首次通过双价sdAb揭示"空间互补+功能叠加"的协同效应：V2C3阻断病毒与细胞受体结合，V3A8f抑制病毒膜融合，形成双重阻断机制。
- Cryo-EM结构解析显示，sdAb通过非共价键（氢键、疏水作用）与病毒包膜蛋白的E1-E2融合界面形成深度结合，其中关键残基（如E1的Y273、E2的F267）被多抗体同时覆盖。

2. **抗病毒逃逸策略**：
- 通过结合病毒包膜蛋白的保守区域（如E1的跨膜区），抗体对序列差异较大的VEEV亚型仍保持有效（如ID亚型与IAB亚型E1序列相似度达92%）。对E2蛋白的广谱覆盖（保守区占比68%）显著提升跨物种保护能力。
- 研究提出"抗体组合库"概念：将CA-Abd与靶向不同表位的抗体（如抗受体LDLRAD3的单抗）联用，可进一步降低病毒逃逸风险。

3. **应用前景与局限性**：
- **优势**：双价设计在保持单抗特性的同时，通过空间位阻增强对复杂包膜结构的覆盖。融合蛋白技术解决了sdAb半衰期短的问题，为临床转化奠定基础。
- **挑战**：对IC亚型的气溶胶暴露保护率不足（仅降低20%死亡率），需优化抗体组合或开发亚型特异性抗体。此外，尚未验证对大型病毒颗粒（如轮状病毒）的穿透能力。

### 未来研究方向
1. **临床前优化**：
- 开发针对IC亚型的增强型抗体，可能通过定向进化引入E2蛋白的关键突变位点的结合残基。
- 测试静脉注射给药途径，评估抗体在脑脊液中的分布情况。

2. **多病毒平台构建**：
- 建立基于sdAb的双价平台，可整合对西尼罗河病毒、寨卡病毒等阿拉夫拉病毒的特异性抗体。
- 探索与佐剂（如TLR激动剂）联用，激活先天免疫应答增强疗效。

3. **工业化生产验证**：
- 需进行大规模动物实验（如NHP模型），验证抗体在复杂宿主环境中的安全性及疗效。
- 优化生产工艺，确保抗体的一致性和批次稳定性。

该研究为生物威胁防控提供了新思路，其双价抗体设计原则可推广至其他包膜病毒（如冠状病毒、埃博拉病毒）。后续研究需重点突破亚型特异性限制，推动从实验室向公共卫生领域的转化应用。