Rhs毒素多免疫阵列：细菌竞争中的广谱防御新机制

《Current Biology》：Poly-immunity arrays associated with Rhs toxins confer wide protection against competitors

本期推荐一项关于细菌竞争机制的重要研究。为探究细菌如何抵御近缘物种分泌的Rhs多态性毒素，Martinkus等人系统分析了Photorhabdus和Xenorhabdus菌株基因组中的多免疫基因阵列。研究发现这些孤儿免疫蛋白可有效中和竞争者毒素，且其基因簇与新型Xer passenger cassette (XPC)遗传模块紧密关联。该工作揭示了细菌通过积累免疫基因实现广谱防护的新策略，为理解Rhs与CDI系统的协同进化提供了关键线索。

　　

在微生物世界的隐秘战场上，细菌们演化出了精密的分子武器系统来争夺生存资源。其中，多态性毒素作为细菌竞争的利器，以其高度可变的C端毒素结构域和专一的免疫蛋白配对而著称。重组热点（Rhs）蛋白和接触依赖性生长抑制（CDI）系统是这类毒素的典型代表，它们通过不同的分泌机制（分别为VI型分泌系统T6SS和Vb型分泌系统T5bSS）将毒素递送至目标细胞。然而，一个长期困扰科学家的问题是：在细菌基因组中，尤其是在Rhs或CdiA毒素基因下游，常常存在一系列“孤儿”毒素结构域-免疫蛋白对或单独的免疫蛋白（假）基因。这些元件的进化起源、生物学功能及其在毒素多样性产生中的作用，一直是该领域争论的焦点。

以往的观点认为，这些孤儿对可能作为新型毒性活性的储备库，通过重组到分泌模块上促进毒素多样化。但也有假说指出，它们可能直接参与防御。为了厘清这一问题，由Julius Martinkus、Nadège Ginibre-Supersac等人领导的研究团队，以昆虫病原菌Photorhabdus和Xenorhabdus为模型，展开了深入探索。他们的研究成果发表在《Current Biology》上，揭示了这些“孤儿”免疫基因阵列实际上是细菌抵御竞争对手毒素的“军火库”，并发现了一个可能驱动毒素-免疫模块多样化和水平传播的保守遗传元件。

研究人员综合运用了生物信息学分析、蛋白质结构预测（AlphaFold3）、体外毒性中和实验、基因表达分析（RT-PCR）等多种技术手段。生物信息学分析涵盖了NCBI数据库中54个Photorhabdus和Xenorhabdus基因组，用于鉴定Rhs毒素和免疫蛋白家族。毒性实验在异源大肠杆菌宿主中进行，通过共表达毒素和免疫基因并观察生长抑制情况来验证功能。基因表达分析则使用实验室培养的Photorhabdus laumondii TT01和Xenorhabdus菌株。

孤儿免疫蛋白是Rhs1和tri23基因下游的编码产物

研究始于对Photorhabdus laumondii TT01菌株T6SS基因座的细致观察。该基因座包含一个编码Rhs1毒素的基因，其下游是已知的免疫蛋白Tri23。然而，研究人员在tri23下游还发现了四个小的开放阅读框（ORF），它们编码的蛋白质与已知的免疫蛋白结构域具有同源性，提示它们可能是针对其他Rhs毒素的免疫蛋白。通过同源性搜索，他们在近缘的Xenorhabdus物种中找到了这些孤儿免疫蛋白的同源物，这些同源物与完整的Rhs毒素蛋白成对出现。这些孤儿免疫蛋白与Xenorhabdus中的同源物序列相似度各异，但AlphaFold3预测的结构显示，每个P. laumondii的孤儿免疫蛋白都与其Xenorhabdus同源物结构高度相似，暗示了功能的保守性。

P. laumondii TT01的孤儿免疫蛋白可抵御Xenorhabdus的Rhs毒素

为了验证这些孤儿免疫蛋白的功能，研究团队将Xenorhabdus的Rhs毒素C端结构域与P. laumondii的孤儿免疫蛋白基因在大肠杆菌中共表达。毒性实验结果表明，大多数P. laumondii的孤儿免疫蛋白能够有效中和其同源Xenorhabdus毒素，其保护效果与序列相似度大致相关。例如，pImmO1, pImmO2和pImmO3分别能有效中和Xenorhabdus的Tox1, Tox2和Tox3，效果不亚于毒素自身的认知免疫蛋白。然而，pImmO4由于与认知免疫蛋白序列一致性较低（52%），未能提供保护。有趣的是，来自X. japonica的孤儿免疫蛋白xjImmO4，尽管与xnImm1序列一致性最高，却意外地无法中和xnTox1。

中和能力可能因单点突变而丧失

针对xjImmO4失效的现象，研究人员通过比较序列和AlphaFold3结构模型，发现xjImmO4在预测的毒素-免疫蛋白相互作用界面有三个关键残基（Q47, D57, D58）发生了改变。将xjImmO4中的Q47或D58单个回复突变后，其中和xnTox1的能力得以恢复，达到与xnImm1相当的水平。这表明毒素-免疫蛋白对的兼容性非常精细，单个氨基酸的改变就足以废除中和作用，反映了二者在界面上的快速协同进化。

Photorhabdus基因组中Rhs毒素下游聚集了多个免疫蛋白

为了评估免疫基因成簇形成“多免疫岛屿”的普遍性，研究人员对54个Photorhabdus和Xenorhabdus基因组进行了比较基因组学分析。他们鉴定出181个Rhs毒素及其紧邻下游的认知免疫蛋白，这些免疫蛋白根据序列相似性（>50%同一性）可划分为95个家族。对每个家族的代表性毒素进行结构预测和功能注释发现，大多数为核酸酶、ADP-核糖基转移酶或脱氨酶等。进一步分析四个完整组装的Photorhabdus基因组发现，每个基因组中免疫基因的数量远多于全长Rhs基因，它们以物种特异性的镶嵌模式聚集在Rhs基因下游，形成了复杂的多免疫阵列。

孤儿免疫基因的表达

RT-PCR分析证实，在实验室条件下（营养琼脂培养基，28°C培养16小时），所检测的Xenorhabdus rhs基因及其认知免疫基因，以及P. laumondii TT01的三个全长rhs基因均能转录。更重要的是，P. laumondii TT01的13个孤儿免疫基因中，有5个在测试条件下有表达，而其余基因表达信号微弱或检测不到。位于较短基因岛（如rhs2和rhs3下游）的孤儿免疫基因表达更为活跃。这表明，约一半的P. laumondii孤儿免疫蛋白在测试条件下是活跃表达的，从而为抵御近缘物种的Rhs毒素提供了即时保护。

免疫基因后跟随一个保守的4基因盒

对多免疫基因岛基因组背景的注释揭示了一个关键发现：在许多孤儿免疫基因之间，穿插着一个高度保守的由四个基因组成的簇，研究人员将其命名为Xer passenger cassette (XPC)。该盒包含：（1）一个SymE-like DNA结合蛋白；（2）一个推定的螺旋-转角-螺旋转录调节因子；（3）一个具有引发酶和解旋酶结构域的蛋白；（4）一个XerC/D-like位点特异性酪氨酸重组酶（XerP）。XPC在P. thracensis和P. asymbiotica的基因组中尤为常见。令人惊讶的是，基因组范围内的搜索发现，XPC也与其他多态性毒素系统——CDI（Contact-Dependent growth Inhibition）系统的毒素-免疫蛋白对相关联。AlphaFold3多聚体建模证实了CDI毒素与其推定的免疫蛋白能形成高置信度的复合物，体外毒性实验也验证了其功能。

研究结论与讨论

本研究挑战了关于Rhs基因座进化的传统观点。生物信息学分析表明，大多数所谓的“孤儿毒素”ORF实际上是缺失或由无义突变截短的，显示出基因组衰变而非活跃的毒素多样化迹象。相反，编码孤儿免疫蛋白的基因在Photorhabdus基因组中不断积累。这些免疫蛋白高度保守，广泛表达，并保留着中和由近缘物种递送的同源毒素的能力。据此，研究团队提出了一个以免疫为核心的Rhs基因座进化新模型：免疫基因，而非毒素基因，是细菌间动力学和毒素多样化的主要驱动力。细菌通过积累针对竞争对手毒素的多重耐药基因座，形成“多免疫阵列”，这种防御策略反过来又驱动了分泌毒素的多样化和进化。

本研究最重要的发现之一是鉴定出XPC这一新型遗传元件。XPC与Rhs和CDI这两种分泌机制迥异的多态性毒素系统相关联，表明它们共享一个共同的多样化机制。这一观点得到了以下事实的支持：在Photorhabdus和Xenorhabdus物种中发现了极其相似的毒素-免疫蛋白对分别与Rhs和CDI系统关联。XPC可能作为一种自主移动元件，通过其编码的XerP重组酶，促进毒素-免疫模块的整合和水平传播，从而驱动细菌竞争武器库的不断更新和扩展。

综上所述，这项研究揭示了细菌通过构建多免疫阵列来获得广谱保护的新策略，并发现了可能普遍存在于细菌界、驱动多态性毒素系统进化的XPC遗传模块。这些发现不仅深化了对细菌竞争和协同进化机制的理解，也为未来研究毒素-免疫模块的传播和多样化提供了新的框架和方向。