血脑屏障开放后细胞外颗粒动态释放预测胶质母细胞瘤对紫杉醇敏感性

《Nature Communications》：Dynamic release of extracellular particles after opening of the blood-brain barrier predicts glioblastoma susceptibility to paclitaxel

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)缺乏有效治疗监测手段的难题，开发了基于膜联蛋白V(Annexin-V)化学的微流控装置GlioExoChip，用于捕获血脑屏障(BBB)开放后释放的细胞外囊泡和颗粒(EVPs)。研究发现紫杉醇(PTX)敏感型GBM细胞在药物诱导凋亡时释放磷酸酰丝氨酸(PS)阳性EVPs，且患者循环EVPs动态变化与总体生存期显著相关(p=0.035)，为GBM治疗反应提供了实时液体活检新策略。

　　

在大脑深处，胶质母细胞瘤(GBM)如同潜伏的刺客，作为成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，它让医生们束手无策。尽管患者接受最大安全切除手术，随后进行标准化放化疗，但中位生存期仍不足两年。血脑屏障(BBB)如同一道坚固的城墙，不仅限制了治疗药物进入大脑，也阻碍了肿瘤特异性生物标志物进入外周循环，使得医生难以实时监测治疗效果。

更令人困扰的是，传统影像学检查如MRI增强扫描，往往难以区分真正的肿瘤进展与治疗后炎症反应（称为“假性进展”）。这种不确定性使得临床决策变得复杂，医生难以判断何时需要调整治疗方案。液体活检技术虽然在其他癌症中展现出巨大潜力，但在GBM中的应用却因血脑屏障的限制而举步维艰。

正是在这样的背景下，一项发表于《Nature Communications》的研究带来了突破性进展。研究人员开发了一种创新的微流控平台GlioExoChip，结合超声开放血脑屏障技术，成功捕捉到GBM特异的细胞外囊泡和颗粒(EVPs)，并发现这些微小颗粒的动态变化能够预测患者对紫杉醇(PTX)的治疗反应。

研究团队采用微流控芯片技术、纳米颗粒追踪分析(NTA)、蛋白质组学、Western blot和扫描电子显微镜(SEM)等多种技术手段，对18名接受SC-9植入式超声设备治疗的复发GBM患者进行纵向血浆样本分析。该临床试验(NCT04528680)中，患者每三周接受一次低强度脉冲超声联合微泡(LIPU/MB)的血脑屏障开放治疗，同时静脉注射紫杉醇。

研究结果显示，GlioExoChip设备通过Annexin-V与EVPs表面的磷酸酰丝氨酸(PS)特异性结合，实现了对GBM来源EVPs的高效捕获。与传统的抗EGFR或抗CD63方法相比，Annexin-V功能化设备的捕获效率显著提高（U87细胞系达93.03±3.31%，GBM6细胞系达96.77±0.72%）。蛋白质组学分析进一步证实，从GBM患者血浆中分离的EVPs呈现出与健康对照截然不同的蛋白表达模式，其中SERPINA3显著上调，APOC1明显下调，这些差异表达蛋白的特征与GBM微环境中恶性细胞的基因表达特征高度一致。

开发并验证用于捕获GBM来源EVPs的GlioExoChip

研究人员优化了一种能够从GBM细胞系和患者血浆样本中捕获肿瘤特异性EVPs的微流控平台。该设备利用PDMS和玻璃载玻片之间的通道，当血浆等流体通过时，主要在外泌体大小范围内的EVPs被捕获，而囊泡耗尽的流体从设备远端排出。通过沉积对特定EVP表面蛋白或磷脂具有亲和力的抗体，可以实现癌症特异性EVPs的分离。实验表明，与基于抗EGFR和抗CD63的技术相比，Annexin-V涂覆的设备表现出更高的捕获效率，且从非肿瘤性星形胶质细胞中捕获的EVPs较少。

通过GlioExoChip从血浆中分离患者来源的GBM EVPs

研究团队进一步测试了GlioExoChip在GBM患者血浆样本中的应用效果。结果显示，仅需30μL血浆即可提供可检测范围的EVPs（约10? EVPs/mL）。设备间重复性实验表明，GBM患者与健康个体的EVP浓度分布存在显著差异，且各设备间相关性高达95%以上。与GBM细胞系结果一致，Annexin-V在捕获患者来源EVPs方面优于抗CD63抗体，而健康血浆中PS表达EVP（与GBM相关）的存在极少。蛋白质含量定量分析证实，Annexin-V设备从患者样本中分离的蛋白质显著多于CD63基捕获方法，且患者样本的蛋白质含量远高于健康对照。

1和调整后p值<0.05确定），并标记了前三个基因。使用DESeq2进行统计分析，采用双尾Wald检验。E GBM患者来源的EVP显示APOC1和DMKN显著下调，SERPINA3上调，基于scRNA-seq数据，这与GBM微环境中恶性细胞的表达模式最接近。每列的表达值被标准化以显示每个基因在不同细胞类型中的范围。'>

治疗期间循环EVPs与影像学增强的一致性

利用经过验证的GlioExoChip，研究人员分析了近期I期临床试验中获得的132个纵向血浆样本。研究发现，血脑屏障开放后EVP浓度的变化与患者当时的肿瘤增强程度显著相关（p=0.005，r=0.52；Pearson相关）。纵向分析显示，在至少三个治疗周期的患者中，血脑屏障开放后EVP浓度的变化与MRI增强程度随时间推移密切对应，而仅考虑超声前EVP浓度时，这种关联性大大减弱。这表明血脑屏障开放增强了EVPs向血液循环的释放，为监测肿瘤进展提供了更敏感的指标。

LIPU/MB后EVP释放作为胶质母细胞瘤对紫杉醇敏感性和反应性的生物标志物

鉴于GlioExoChip专为捕获凋亡GBM细胞释放的PS阳性EVPs而设计，研究人员假设纵向数据可以揭示每位患者对PTX治疗的反应。体外实验证实，PTX处理导致药物敏感型GBM细胞系（GBM43C）出现剂量依赖性的细胞凋亡和EVP释放增加，而耐药细胞系（GBM43T）则无此现象。基于这一发现，研究团队定义了“EVP斜率”变量，即第一和第二治疗周期间血脑屏障开放后EVP浓度变化比率的差异除以周期间隔天数。分析显示，EVP斜率为正的患者（表明治疗诱导的EVP释放增加）中位总生存期显著长于斜率为负的患者（610天 vs 223天，Cox风险比=0.203，Wald检验p=0.05），且Kaplan-Meier曲线存在显著差异（对数秩检验p=0.035）。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种高效捕获GBM特异性EVPs的微流控设备，并证实血脑屏障开放后EVP的释放动态能够预测PTX治疗反应。这一发现为GBM的精准治疗提供了重要突破：通过微创血液检测即可实时评估治疗效果，克服了传统影像学在区分真假进展方面的局限性。特别值得注意的是，治疗初期（仅两个周期）的EVP释放变化即可预测患者长期生存，为早期调整治疗方案提供了宝贵时间窗口。

该技术的临床意义深远：对于接受血脑屏障开放联合化疗的GBM患者，GlioExoChip平台可作为一种“液体活检”工具，动态监测肿瘤对治疗的反应。相比需要反复脑部活检或依赖不精确的影像学评估，这种方法更加安全、便捷，且能更真实地反映肿瘤生物学行为。此外，基于PS的EVP捕获策略可能适用于其他诱导神经胶质瘤细胞凋亡的疗法，为脑肿瘤治疗监测开辟了新途径。

研究也存在一定局限性，包括样本量较小需要更大队列验证，以及植入式超声设备的应用限制。未来研究可进一步探索EVP内蛋白质和核酸内容物随治疗时间的变化规律，并拓展该平台在其他癌症类型和治疗场景中的应用。随着标准化采集协议的建立和疾病特异性材料分析的完善，基于EVP的液体活检技术有望优化恶性胶质瘤患者的治疗管理和临床结局。