催化性淀粉样蛋白的结构-活性关系

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Structure-activity relationships in catalytic amyloids

催化性淀粉样体通过金属离子与短肽自组装实现高效水解催化，序列微调显著影响催化效率和底物特异性。首次建立4-甲基伞形酮酯类底物的kuncat基准值，其催化活性与最优de novo球蛋白酶相当。研究揭示了催化活性与结构特征（如β折叠构象、金属结合界面）的构效关系，为设计可调酯酶活性的人工肽聚集体提供理论依据。

　　

作者：Shams Aaghaz、Liam R. Marshall、Ivan V. Korendovych

美国德克萨斯州韦科市贝尔大学化学与生物化学系，地址：One Bear Place, Waco, TX 76706

摘要

基于短肽的组装体与金属离子结合，是一种简单而有效的催化平台。本研究探讨了从头合成的淀粉样肽的催化特性，这些肽在不同水解底物下的催化性能变化，以及催化性能与结构特征之间的关系。我们发现，即使是对肽序列进行微小的修改，也会对催化效率和底物选择性产生显著影响。我们还为4-甲基伞形花酮酯（4-MU-Ac）建立了k_uncat基准值，这种底物在蛋白质设计研究中越来越受到关注。我们的研究结果表明，所制备的催化性淀粉样肽具有与最佳从头合成的球状酶相当的活性水平。这项工作扩展了人们对催化性淀粉样肽功能的理解，并探索了开发具有可调酯酶活性的最小化肽骨架的设计原则。

引言

金属酶在催化生理关键反应中起着核心作用。[1],[2],[3],[4] 在数十亿年的进化过程中，形成了多种具有优异选择性和活性的金属酶。然而，尽管该领域取得了最新进展，但开发出适用于天然和非天然反应的稳健且功能性的合成金属酶仍然是一个尚未完全解决的问题。[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12] 设计金属蛋白的一种常见方法依赖于“酶模型”（theozyme），这是一种理论上推导出的过渡态的三维表示，随后将其计算导入蛋白质骨架并进行进一步优化。[13,14] 这种方法取得了一些显著成果，但仍无法达到天然酶的高活性水平。[14,15]

另一种方法是尝试重现自然界中金属蛋白的进化路径。考虑到祖先金属酶的结构可能比我们今天看到的复杂三维酶更为简单，[16],[17],[18] 有假说认为早期酶是由自组装形成的短肽构成的，这一假设得到了越来越多具有催化活性的超分子肽组装体的支持。[19],[20],[21] 随着冷冻电镜（cryoEM）数据的丰富，人们逐渐认识到即使是非常短的肽也能形成远超经典交叉β结构的复杂三维结构。[22],[23],[24],[25],[26]

底物识别是酶设计的关键，随着研究的深入，我们开始考虑活性较低但化学结构更复杂的底物。[27,28] 研究多种底物可以揭示所研究催化剂的相对选择性，并提供关于反应机制的物理化学见解。这有助于设计者构建原始的底物识别位点，或开发针对不同肽序列的行为模式。以往的设计工作主要集中在如何针对已知底物优化酶结构，但催化性淀粉样肽显示出越来越多样化和复杂的特性，因此我们感兴趣的是研究这些催化剂对替代底物的反应性（见图1）。[29],[30],[31],[32],[33],[34],[35],[36],[37],[38],[39],[40],[41],[42] 在自然系统中，通常观察到一个底物的偏好，而催化性淀粉样肽提供了一个研究金属蛋白行为的平台，使其能够处理不太特异性的底物。

水解催化剂因其在酶设计中的模型作用而备受关注，这类催化剂有丰富的设计和潜在底物选择。[15],[43],[44],[45],[46],[47],[48],[49],[50] 金属水解酶对生命过程至关重要，可以设计它们来催化具有工业价值的反应，例如分解环境有害物质。[5,21,47],[51],[52],[53],[54],[55],[56],[57],[58],[59],[60] 我们认为，结构较为简单的催化系统会表现出更广泛的底物选择性，因为它们能与更多类型的底物相互作用、结合并发生水解。虽然之前有一些极简化的水解酶模型（无论是否含有辅因子），但这些模型主要集中在对硝基苯酚类底物上，我们希望扩大底物范围，为未来的设计提供更多参考。[21,43,47,61,62] 我们之前报道了一系列结合锌的淀粉样纤维，它们能催化对硝基苯酚醋酸酯的水解，其活性与碳酸酐酶相当（按重量计），并且可以在异质纤维混合物中混合使用，甚至在作为大环结构时仍保持活性。[19,30,37,41],[63],[64],[65],[66] 4-甲基伞形花酮酯（4MU-Ac）已被用作从头设计的丝氨酸水解酶的底物，其他香豆素衍生物也被研究作为金属蛋白酶的底物。[46,57,67,68] 香豆素还是重要的次级代谢物，参与信号传导和应激反应，例如4-甲基伞形花酮已被发现能增强M. sieversii的抗旱能力。[69]

据认为，祖先酶具有极高的底物选择性，这种进化特性使它们能够在进化过程中承担多种功能。[70,71] 由于我们的催化剂设计非常简约，我们预计它们能够水解广泛的底物，因此我们可以进一步明确有效水解催化的设计规则。因此，我们研究了多种催化性淀粉样肽对4-甲基伞形花酮酯的水解行为，并直接探讨了给定底物的k_uncat值与其他底物之间的关系。我们的研究结果揭示了设计淀粉样肽的序列依赖性，并阐明了不同底物间的结构-活性关系。

材料与仪器

所有试剂均从Ambeed、Fisher Scientific、VWR、Sigma Aldrich和Chem-Impex购买，使用前无需额外纯化。所有合成反应均在氮气氛围下进行。肽的合成使用了Gyros PurePep Chorus肽合成仪，采用了从先前方法改进的室温荧光甲氧基羰基（Fmoc）固相合成技术。[72] 合成的肽通过线性梯度（溶剂A：0.1% TFA）进行纯化。

4MU-Ac的合成与表征

4MU-Ac的合成方法如实验部分所述，采用Ghosh及其同事开发的优化的一锅法，通过4-甲基伞形花酮与乙酸酐的酰化反应实现，从而定量且高纯度地获得了所需底物。[74] NMR和ESI-MS谱图见图S2-S4。

我们测定了pH 8条件下4MU-Ac和pNPA的k_uncat值（见图2）。k_uncat值对于比较不同底物的活性至关重要。

讨论

酶的广泛底物选择性被认为是一种进化特征，它使得酶能够根据需要执行多种功能。[79,80] 逻辑上，最初存在的简单、广谱的酶能够催化多种功能，随着酶、系统和生物体的进化，这些酶逐渐得到优化和专门化。[81],[82],[83] 此前已有研究表明淀粉样肽可能是早期酶的候选者，本工作证实了它们的广谱性。

作者贡献声明

Shams Aaghaz：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学设计、实验研究、概念构建。 Liam R. Marshall：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、概念构建。 Ivan V. Korendovych：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督工作、资源协调、项目管理、方法学设计、实验研究、资金筹集、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了NIH（资助编号：GM119634、GM103521）和Welch基金会的支持。作者感谢贝尔大学（Waco, TX）的CMI（显微镜与成像中心）在显微镜技术和图像分析方面提供的支持，同时感谢Matsumoto博士在底物纯化方面的协助。