用于C反应蛋白磁共振成像的靶向钆标记金纳米颗粒

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Targeted gadolinium-labeled gold nanoparticles for MR imaging of C-reactive protein

CRP靶向钆标记金纳米颗粒开发为炎症MRI成像新探针，具有高灵敏度、低毒性和精准定位优势。

　　

作者：Naedum I. DomNwachukwu、Matthew D. Bailey、Minrui Luo、Jonathan Schiff、Andrew Brotherton、Bennet Phillips-Sorich、Jonathan Rivnay、Thomas J. Meade 所属机构：美国伊利诺伊州埃文斯顿市西北大学生物医学工程系

摘要 C-反应蛋白（CRP）在受伤、感染或疾病引起的炎症早期会迅速升高，并与受影响组织中的受损细胞结合，因此成为成像研究的理想靶点。现有的临床检测方法仅能测量血液中的CRP水平，无法提供关于炎症位置或其结构影响的空间信息。直接观察组织中的CRP有助于更早地发现炎症、精确定位病变部位、监测治疗反应以及识别亚临床疾病。本文报道了一种针对CRP的磁共振（MR）成像对比剂的开发成果，该对比剂可用于炎症的分子成像。我们合成了通过磷脂酰胆碱（PC）配体与CRP结合的钆标记金纳米颗粒（AuNP），即PC-Gd@AuNP。这些颗粒尺寸均匀（约2纳米），且钆与磷脂酰胆碱的表面比例可调。生物物理学表征显示其具有较高的CRP结合亲和力（K_D = 135 ± 63.96 nM），并在复杂的生物液体模型中表现出良好的特异性。PC-Gd@AuNP在HeLa细胞中的细胞毒性阈值（LC₅₀）为1 μM，在HepG2细胞中为0.284 μM。这些结果表明，PC-Gd@AuNP是一种有前景的分子MRI对比剂，能够直接显示炎症组织中的CRP沉积情况，从而推进炎症性疾病的无创检测和监测。

引言

C-反应蛋白（CRP）是一种由肝脏在白细胞介素（IL）-1和IL-6刺激下产生的五聚体急性期反应物。它通过与受损细胞上的磷脂酰胆碱结合并激活经典补体途径，在炎症过程中发挥关键作用[1,2]。急性炎症期间CRP水平可升高至正常值的1000倍，并与心肌炎和血管炎等疾病的严重程度密切相关[3, [4], [5], [6]]。尽管通常通过浊度法或散射光度法检测血液中的CRP，但这些方法缺乏空间信息和疾病特异性[7]。 目前的炎症临床成像主要依赖于正电子发射断层扫描（PET），尤其是使用放射性示踪剂氟脱氧葡萄糖（FDG）。虽然PET对代谢活动具有高度敏感性，但需要使用电离辐射，且除非与计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）结合使用，否则难以获得详细的解剖结构信息[8, [9], [10], [11]]。PET-CT和PET-MRI虽然能提供更多背景信息，但会增加成本和辐射负担[11]。此外，PET在显示软组织细节方面存在局限性，不适合检测血管狭窄等结构变化[11,12]。 磁共振成像（MRI）无需电离辐射，具有出色的软组织对比度和三维分辨率，是炎症成像的理想选择。然而，其缺点是对分子靶点的敏感性较低。通过使用专门的对比剂（尤其是那些能在特定分子位点积累的对比剂）可以克服这一局限。基于钆（Gd）的对比剂可通过缩短附近质子的弛豫时间来增强MRI信号[12,13]。当这些对比剂与疾病特异性配体结合时，可以实现炎症过程的精确分子成像，为PET提供了一种安全有效的替代方案[12, [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24]]。 金纳米颗粒（AuNP）是用于分子MRI对比剂的理想候选材料。它们具有较大的表面积，便于与钆基螯合物及如磷脂酰胆碱（PC）等靶向分子结合[25]。AuNP具有化学稳定性、易于表面功能化，并能携带大量钆离子，从而增强局部对比度[26], [27], [28], [29]]。尽管已研究过在层流实验中用CRP结合分子功能化的AuNP来检测CRP[30,31]，但它们作为直接成像CRP的靶向MRI对比剂的潜力尚未得到充分探索。本研究旨在合成和表征经过钆标记和磷脂酰胆碱修饰的AuNP，以实现通过MRI进行炎症的无创高分辨率成像。

AuNP的合成

我们采用了Brust-Schiffrin方法制备了表面可交换分子的1.8纳米AuNP[32,33]。使用十二胺（DDA）作为稳定剂（如我们团队之前所用[14,15,34]）。通过三次20,000 x g离心处理（每次10分钟）去除颗粒聚集体。通过紫外-可见光（UV–Vis）光谱确认了颗粒的尺寸和形状。

AuNP的合成与表征

通过UV–Vis光谱确认成功合成了直径约为2纳米的DDA稳定的AuNP，其在515纳米处显示出特征性的吸收峰下降[36,37]。图1B中的虚线黑色曲线代表三批独立制备的toluene悬浮DDA AuNP的平均光谱，各批次之间没有显著差异。同样，三批独立制备的巯基修饰AuNP的吸收光谱经过归一化处理后也显示出高度一致性。

讨论

PC-Gd@AuNP的尺寸约为2纳米，呈球形，这一结果通过UV–Vis光谱和透射电子显微镜（TEM）得到验证。UV–Vis数据表明，所采用的合成工艺能够生产出结构一致的颗粒。Dotarem?（Gd-DOTA）是美国最常用的临床MRI对比剂之一，其在37°C下的钆纵向弛豫率为2.9 mM^?1 s^?1[39]。

结论

本研究开发了一种基于金纳米颗粒的MRI对比剂，该对比剂对C-反应蛋白（CRP）具有高亲和力和选择性，为炎症的分子成像奠定了基础。模块化的合成路线可实现颗粒尺寸和表面功能的调节，便于针对不同生物靶点进行快速优化。尽管初步的体外实验显示其具有较低的细胞毒性，但后续工作将致力于明确其毒性机制并优化颗粒表面特性。

作者贡献声明

- Naedum I. DomNwachukwu：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、验证、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析及概念构思。 - Matthew D. Bailey：负责监督、方法学设计、数据分析及概念构思。 - Minrui Luo：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、方法学设计及数据分析。 - Jonathan Schiff：负责撰写、审稿与数据管理。 - Andrew Brotherton：负责撰写及审稿工作。

利益冲突声明

作者声明以下可能的利益冲突：Thomas Meade持有西北大学的专利申请。其他作者均声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢 感谢国家神经疾病与中风研究所（5R01NS115571）、国家癌症研究所（NIH5R01CA260847-04）、ARPA-H以及西北大学本科生研究资助办公室的财政支持。ICP-MS分析由Rebecca Sponenburg完成；金属分析在西北大学定量生物元素成像中心进行，分析费用由芝加哥生物医学联盟提供，并得到了Searle基金会的支持。