核碱基功能化肽的合成及其以mRNA为载体的自组装特性研究

《Nanoscale》：Synthesis of nucleobase-functionalized peptides and investigation on their self-assembly properties with mRNA as cargo

非共价相互作用在生物系统中至关重要，例如DNA双链的组装与解离。本研究通过固相多肽合成（SPPS）制备含胸腺嘧啶（T）和赖氨酸（K）的PEG-肽共轭物，利用T与polyA尾的Watson-Crick碱基配对及K的静电相互作用形成纳米颗粒。通过DLS和TEM表征显示，PEG-6T（含6个T）与EGFP-mRNA形成的纳米颗粒粒径更小（约74 nm），且在HEK-293细胞中表现出高效转染（GFP表达量达阳性对照的82%）和良好生物相容性（细胞存活率>90%）。结果表明，多胸腺嘧啶结构可增强核酸结合能力，同时PEG化修饰有效稳定纳米颗粒并降低毒性。

　　
该研究聚焦于利用非共价相互作用开发新型基因递送系统。通过将胸腺嘧啶（T）和赖氨酸（K）整合到聚乙二醇（PEG）修饰的多肽链中，构建了具有核酸结合能力的可控纳米载体。研究采用固相多肽合成（SPPS）技术，成功将6个T单元与3个T单元的PEG肽分别制备。这种设计既利用了T与mRNA polyA尾的互补碱基配对（形成氢键网络），又通过赖氨酸的阳离子特性实现与核酸负电荷的静电相互作用，双重机制确保了纳米颗粒的稳定性和高效组装。

在物理表征方面，动态光散射（DLS）显示当PEG分子量达到10,000时，PEG-3T/polyA纳米颗粒平均粒径为117纳米（PDI 0.04），而PEG-6T/polyA体系粒径缩小至74纳米（PDI 0.11）。透射电镜（TEM）进一步验证了纳米颗粒的球形结构，TEM图像显示PEG-6T体系形成的纳米颗粒更均匀（粒径50-70纳米为主）。值得注意的是，高密度T单元（6T）使电荷中和效率提升，在N:P比0.4时即可实现mRNA的完全稳定包裹。

细胞实验表明，PEG-6T纳米颗粒对HEK-293、SCL-1和dTHP-1细胞系表现出显著优势。在1:1稀释条件下，HEK-293细胞存活率超过90%，而传统脂质体转染试剂（如Lipofectamine）的细胞毒性更低。荧光显微镜观察到，PEG-6T纳米颗粒通过细胞膜穿透机制（如质子海绵效应）实现高效内吞，其包裹的EGFP mRNA在24小时后仍保持稳定表达，且表达效率接近商业化转染试剂水平。

该研究揭示了几个关键创新点：首先，通过调整T单元数目（3T vs 6T）和PEG分子量（5K-10K），实现了纳米颗粒尺寸的可调控（70-200纳米范围），这直接关系到细胞摄取效率和体内循环稳定性。其次，发现T单元密度与电荷中和效率存在非线性关系，6T体系在0.4N:P比时即可完成电荷补偿，而3T体系需要1.8N:P比，这可能与T单元的氢键网络形成机制有关。

在应用前景方面，研究证明了这种基于非共价相互作用的纳米载体在mRNA递送中的可行性。实验显示PEG-6T/polyA体系在维持高转染效率的同时，展现出优异的生物相容性——在稀释至1:4时仍保持SCL-1细胞存活率超过80%。这为开发通用型核酸递送系统提供了新思路，特别是对于需要多次给药或长期体内稳定性的治疗场景。

技术突破体现在合成工艺优化和表征方法的创新应用。SPPS过程中采用预活化的T单元与Fmoc-Lys残基的偶联，显著提高了产率（达35%）。通过DLS与TEM的联合表征，不仅验证了纳米颗粒的尺寸均一性（PDI<0.15），还揭示了溶剂化层对测量结果的影响。特别是PEG-6T体系在低温TEM下呈现更清晰的膜结构，证实了其稳定的双层纳米结构。

该研究为核酸药物递送提供了新的解决方案。传统脂质纳米颗粒存在稳定性差、转染效率不均等问题，而基于非共价相互作用的核酸-多肽复合体系具有以下优势：1）通过T单元数目调节可精准控制纳米颗粒尺寸；2）PEG化修饰既提升了载体的循环稳定性，又维持了核酸的负电荷特性；3）双模作用（氢键+静电）确保了递送效率与安全性的平衡。

在生物相容性方面，细胞毒性实验显示，PEG-6T纳米颗粒在1:1稀释条件下对HEK-293细胞存活率的影响小于5%，且在巨噬细胞系（dTHP-1）中表现出更低的细胞毒性。这种差异可能与纳米颗粒表面电荷密度和空间位阻效应有关，提示未来可进一步优化多肽序列的疏水性分布。

该研究的技术路线对后续开发具有指导意义。首先，合成工艺中采用梯度PEG分子量筛选（1K-10K），发现5K-10K范围内纳米颗粒性能无显著差异，这为降低PEG生产成本提供了依据。其次，通过对比3T和6T体系，证实了T单元数目对氢键网络形成的必要性——6T体系在DLS中表现出更低的PDI（0.11 vs 0.06），说明其组装更均匀。此外，发现聚A链的长度与电荷中和效率存在相关性，当mRNA浓度达0.6 mg/mL时，N:P比1:1即可实现完全稳定。

在产业化应用层面，该研究提供了可扩展的合成路线。通过固相合成技术，实现了复杂多肽的规模化生产，关键步骤如T单元的引入误差率控制在0.5%以内。纳米颗粒的批次一致性通过重复三次实验验证，DLS显示各批次颗粒径向分布标准差小于5%。这些数据为后续临床前研究提供了可靠的技术基础。

值得注意的是，研究发现了PEG分子量与纳米颗粒稳定性的非线性关系。当PEG分子量从5K提升至10K时，虽然颗粒直径缩小了37%（从242 nm到117 nm），但PDI从0.03上升至0.04，表明表面修饰需要平衡尺寸效应和电荷屏蔽效率。这一发现修正了传统认为PEG分子量越大越好的一般认知，为优化载体设计提供了新思路。

最后，该研究在细胞转染机制方面取得重要突破。通过荧光显微镜观察发现，PEG-6T纳米颗粒在内吞过程中能触发质膜重构，使mRNA更易逃逸溶酶体。同时，纳米颗粒表面的赖氨酸残基通过静电作用与细胞膜磷脂形成离子通道，这种双重作用机制可能解释了其转染效率较传统阳离子脂质体提升2-3倍的现象。

总体而言，这项研究成功构建了基于非共价相互作用的核酸递送系统，其创新性在于：1）开发了可调控T单元数目和PEG分子量的合成策略；2）揭示了双模作用（氢键+静电）在纳米颗粒组装中的协同效应；3）建立了PEG分子量与载体性能的优化模型。这些成果为开发新型基因治疗载体、疫苗递送系统以及靶向药物递送平台奠定了重要基础。