H5N1禽流感病毒对牛细胞适应潜能的进化动态研究

《Nature Communications》：The potential of H5N1 viruses to adapt to bovine cells varies throughout evolution

本研究针对H5N1禽流感病毒跨种传播至牛群并引发疫情的现象，系统评估了不同基因型H5N1病毒在牛细胞中的复制适应性。研究人员通过构建包含60余年进化历史的重组病毒库，发现病毒在牛细胞中的复制能力存在显著基因型差异，且由内部基因组合决定，其中PB2聚合酶亚基突变（如M631L）是关键适应因子。研究还揭示了病毒对牛干扰素反应的调控能力差异，为H5N1病毒在反刍动物中的适应机制提供了重要见解，对禽流感跨种传播风险预警具有重要意义。

　　

2024年初，H5N1高致病性禽流感病毒意外在美国奶牛场引发疫情，这是首次发现禽流感病毒在牛群中大规模传播，立即引起全球公共卫生界的警惕。传统认知中，牛并非流感病毒的天然宿主，尽管早期研究曾发现牛血清中存在流感抗体，且实验显示牛对人和禽流感病毒易感，但从未发生过自然疫情。此次疫情由H5N1病毒2.3.4.4b分支的B3.13基因型引起，该分支自2021年以来在全球鸟类中广泛传播，并感染了多种哺乳动物，包括水貂、臭鼬、浣熊、猫、熊、狐狸以及海豹和海狮等海洋哺乳动物。

要制定有效的防控策略，关键问题是：对牛细胞的适应能力是H5N1病毒的普遍特征，还是仅限于2.3.4.4b分支病毒，或进一步局限于该分支内的某些特定基因型？为此，研究团队开展了一项系统研究，成果发表于《Nature Communications》。

研究人员构建了代表60多年H5N1进化史的重组病毒库，以及其他甲型流感病毒（IAV）作为对照。这些病毒为2:6重配病毒，即含有A/Puerto Rico/8/34（PR8）疫苗株的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）糖蛋白，以及待研究病毒的六个内部基因组片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）。这种设计可直接评估内部基因在牛细胞适应中的作用。病毒在HEK-293T细胞或表达鸡ANP32A的工程细胞中拯救，并在MDCK细胞中扩增滴定。研究还利用了牛皮肤成纤维细胞（BSF）、原代牛鼻成纤维细胞（BNF）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）以及离体牛乳腺组织外植体等多种细胞和组织模型。关键实验技术包括病毒复制动力学分析、微型基因组复制子试验（评估聚合酶活性）、免疫印迹、免疫组织化学/免疫荧光、干扰素敏感性测定、ISRE（干扰素刺激反应元件）荧光素酶报告基因试验以及蛋白质合成关闭分析。

病毒在牛细胞中的复制能力

研究发现，携带北美反刍动物来源内部基因的病毒（如r-Bovine-B3.13, r-Texas/37-B3.13, r-Goat-B3.6, r-Bovine-D1.1）在牛皮肤成纤维细胞（BSF）中复制最快，滴度最高。而许多禽类来源的2.3.4.4b病毒（如EA-2020-A, EA-2022-BB, D1.1, B3.13, euDG）表现出中等复制能力，与一些哺乳动物适应病毒（如马源H3N8、犬源H3N2）相当。相比之下，2.3.4.4b分支出现前的早期H5N1病毒（如r-CHK/Scot/59）复制能力很差。

在牛乳腺外植体模型中，r-Bovine-B3.13同样表现出显著复制优势，病毒抗原主要存在于乳腺池上皮细胞中。所有病毒在禽DF-1细胞中均能有效复制，表明观察到的表型是宿主特异性的。

聚合酶活性与宿主适应

微型基因组复制子试验显示，人源或与人溢出事件相关的病毒聚合酶在人类细胞中活性最高。牛源病毒聚合酶活性中等，而许多禽源病毒聚合酶活性较低。在牛源病毒中，PB2亚基的突变是关键适应因子。例如，r-Bovine-B3.13和其最近的禽类亲缘病毒r-Goose-B3.13之间仅有三个PB2氨基酸差异（E362G, D441N, M631L）。其中，M631L突变已知可增强在哺乳动物细胞中的复制，但本研究显示其效应具有上下文依赖性，且E362G和D441N能进一步协同增强复制。另一个重要的哺乳动物适应突变PB2-E627K，在实验感染奶牛的欧洲基因型病毒（euDG）中出现，能显著增强其在人和牛细胞中的聚合酶活性和复制能力。

内部基因段的协同作用

通过构建仅交换聚合酶复合物（PB2, PB1, PA）和NP基因的4:4重配病毒，发现仅有聚合酶和NP的适应不足以完全解释2:6病毒在牛细胞中的高效复制，提示M和/或NS片段也扮演重要角色。单一片段交换实验证实，将牛B3.13病毒的PB2、PB1或NP片段替换为禽源EA-2020-C病毒的对应片段，会显著降低病毒在牛细胞中的复制，其中PB2的影响最大。然而，单个片段的替换并不能将复制水平降至亲本禽病毒的水平，表明需要多个片段的协同作用才能实现完全适应。在另一组与复制能力较弱的禽源B1.1病毒的片段交换中，牛源PB2能显著挽救禽源病毒的复制缺陷，突出了PB2的关键作用。

对宿主先天免疫的调控

牛源B3.13病毒比其禽类祖先（r-EA-2020-C）对牛I型干扰素（IFN）的抑制作用更不敏感。预先用干扰素处理牛成纤维细胞，能显著抑制禽源病毒的复制，但对牛源病毒的抑制效果较弱。片段交换实验表明，PB2、NP和NS片段都参与了病毒对干扰素反应的抵抗能力。ISRE报告基因实验显示，不同病毒抑制干扰素刺激基因（ISG）表达的能力存在差异，牛适应病毒（如r-Bovine-B3.13, r-Bovine-D1.1）和某些禽源病毒（如r-EA-2022-BB）表现出更强的抑制能力。蛋白质合成关闭实验表明，反刍动物来源的病毒能诱导更显著的宿主蛋白合成关闭。此外，研究证实牛Mx1蛋白能有效限制禽源和牛源H5N1病毒的复制，但其限制效果因病毒而异。人源限制因子BTN3A3能限制部分禽源病毒（如r-Goat-B3.6），但多数牛适应病毒（如r-Bovine-B3.13）因其NP蛋白携带耐药突变（如52H或52N）而能够逃逸。

PB2 M631L突变的关键作用及其背景依赖性

研究重点分析了PB2 M631L突变的功能。将该突变引入禽源r-Goose-B3.13病毒，能增强其复制，但不足以达到牛源B3.13的水平，需要与E362G或D441N组合才能实现最佳复制。将该突变引入多种禽源病毒基因型，发现其增强复制的效果因病毒基因组背景不同而异，能显著增强r-EA-2022-BB和r-Avian-B1.1的复制，但对r-EA-2020-C等病毒无效，表明该突变的表型依赖于病毒内部基因的特定组合。

本研究首次系统评估了代表15种不同H5Nx基因型的H5N1病毒内部基因片段，揭示了H5N1病毒在牛细胞中的复制适应性在整个进化史上存在显著变异。研究表明，虽然与近期牛群疫情相关的2.3.4.4b病毒在牛细胞中表现出增强的复制和免疫逃避能力，但同一分支内的许多其他禽源病毒也拥有支持其在牛细胞中有效复制的内部基因组合。病毒对牛细胞的适应是多基因共同作用的结果，其中PB2聚合酶亚基的适应性突变（如M631L）扮演了关键角色，但其效应受到病毒基因组背景的调制。此外，病毒对牛I型干扰素反应的调控能力也是其成功适应新宿主的重要因素。这些发现强调了H5N1 2.3.4.4b分支病毒具有内在的生物学特性，使其更容易溢出到哺乳动物宿主。对于未来风险评估而言，表征在牛（或其他哺乳动物）细胞中表现出中等复制表型的禽病毒的分子决定簇，与识别在溢出后驱动完全哺乳动物适应的突变同等重要。该研究为理解禽流感病毒跨种传播的分子机制提供了重要见解，对全球流感大流行防范具有深远意义。