YenTc全毒素完整结构揭示几丁质酶整合入ABC毒素的进化基础及其成孔机制

《Nature Communications》：Complete structures of the YenTc holotoxin prepore and pore reveal the evolutionary basis for chitinase incorporation into ABC toxins

本研究针对YenTc全毒素作用机制不明确的问题，通过冷冻电镜技术解析了YenTc全毒素的预穿孔态和纳米盘嵌合成孔态结构，结合AlphaFold2辅助建模揭示了几丁质酶通过类黏附素结构域整合至毒素复合体的分子机制。系统发育分析表明该特征为近期进化事件，研究为ABC毒素亚型分类提供了新见解，对理解病原体致病机制具有重要意义。

　　

在微生物与宿主的军备竞赛中，细菌演化出多种精巧的分子武器来攻击真核细胞。其中，ABC毒素（ABC toxin）作为一类由昆虫病原菌和部分哺乳动物病原体产生的毒素-易位孔形成蛋白，以其独特的“注射器”式工作机制备受关注。这类毒素通常由三个核心组分构成：负责细胞识别的TcA、形成毒素容器的TcB和携带毒性酶域的TcC。然而，人们对这些巨型蛋白复合体的精确组装机制和结构多样性仍知之甚少。

作为ABC毒素家族的特殊成员，Yersinia entomophaga产生的YenTc毒素复合体展现出独特的分子架构：其TcA组分由四条独立多肽链构成，其中两条为功能性几丁质酶，这与经典ABC毒素的单链TcA结构截然不同。更引人深思的是，YenTc对昆虫表现出显著高于同类毒素的毒力，暗示其可能演化出了更高效的入侵策略。但由于缺乏全毒素的高分辨率结构，科学家们一直难以揭示几丁质酶整合的分子基础及其对毒素功能的贡献机制。

为解开这一谜团，研究团队采用单颗粒冷冻电镜技术，成功解析了天然YenTc全毒素在可溶性预穿孔态和脂质纳米盘嵌合成孔态下的完整结构。值得一提的是，所有数据均使用配备K2 Summit直接电子探测器的Tecnai F30场发射透射电镜手动采集，证明了传统仪器仍能完成高难度结构解析，有力推动了冷冻电镜技术的“民主化”进程。

技术方法概要：研究通过表达纯化Yersinia entomophaga MH96菌株的天然YenTc毒素，利用梯度浓度盐酸胍处理诱导成孔后重构于POPC脂质纳米盘。采用冷冻电镜单颗粒分析技术，分别对预穿孔（616张显微图）和成孔态（1222张显微图）进行三维重构，结合AlphaFold2多聚体预测、交联质谱和分子动力学模拟对柔性区域进行混合建模。

研究结果

完整结构揭示构象状态多样性

预穿孔态结构以4.6埃整体分辨率呈现，聚焦细化后TcA区域达4.0埃。成孔态结构分辨率达6.4埃，TcA区域聚焦细化至5.9埃，较既往报道的11埃分辨率有显著提升。结构分析显示，YenTc全毒素呈现典型的五重对称结构，中央预形成α螺旋孔域被主要由α螺旋构成的外壳几乎完全包裹。不对称的TcBC亚基复合体打破了整体对称性，其与TcA组分的接口呈现诱导契合机制。

TcBC组分的β-螺旋桨域在结合TcA后发生构象重排，从孤立状态下的扭曲构象转变为更接近对称的开放构象，形成连接TcBC笼内部与TcA孔域的连续通道。未解析的电子密度表明YenC的毒性酶域以未折叠状态存在于通道内，为毒素转运提供直接证据。

预穿孔向成孔态转变的分子机制

成孔转变伴随TcA组分的显著构象变化，α螺旋外壳发生虹膜式扩张，导致YenA1亚基间所有链间接触消失。孔形成域相对外壳产生垂直位移，通过复合铰链弯曲运动实现：位于YenA2区域的第一个铰点使外壳下部上旋15°，神经氨酸酶样结构域分离；位于YenA1区域的第二个铰点引起更细微运动。与已知结构的PTC3毒素相比，YenTc的孔形成域弹出程度更显著（额外移动40埃），连接肽折叠形成的α螺旋更长（多三个转角）。

几丁质酶整合的结构基础

高分辨率图谱首次清晰揭示了两个几丁质酶结合结构域（CBD）的精确位置：CBD-A（YenA1残基311-472）与Chi2亚基形成主要接口，呈现经典β-三明治折叠；CBD-B（YenA2残基400-520）因构象动态性需结合AlphaFold2多聚体预测、交联质谱（鉴定出Chi1与CBD-B间三个交联键）和分子动力学模拟进行混合建模。Chi2通过N端域延伸的β链与CBD-A形成反平行β片层，占据疏水裂隙；Chi1则通过C端非结构化链锚定于CBD-B的疏水裂隙。值得注意的是，两个CBD均与细菌黏附素结构高度相似，提示几丁质酶整合机制与菌毛聚合的“菊花链”组装存在进化关联。

受体结合域区域的比较分析

CBD-B与PTC3毒素中RBDs结构同源但序列一致性低（9-20%），且相对于PTC3中RBD-B的向上取向，YenTc的CBD-B呈107°向下旋转。这种构象差异由几丁质酶结合产生的空间位阻导致，且与PTC3中新发现的预穿孔中间态构象相似，提示YenTc可能代表一种“预激活”状态。进化分析表明，CBD-B和RBD-B均插入保守神经氨酸酶样结构域的同一循环区域，提示该位点为进化热点。

系统发育分析揭示ABC毒素进化新谱系

通过对ABC毒素基因座进行系统发育分析，研究团队提出了新的分类框架：Type 3（古老谱系，单链TcA与融合TcBC）、Type 1（单链TcA与分离TcB/TcC，含RBDs）和Type 2（分裂TcA，进一步分为含几丁质酶的2A型和不含几丁质酶的2B型）。几丁质酶结合功能仅存在于近期进化的2A型毒素中，且CBDs严格限于该谱系。Type 2A毒素中发现的“伪RBD-A”域提示其可能由Type 1毒素的RBD-A退化而来。

结论与展望

该研究首次解析了分裂TcA型ABC全毒素的完整结构，揭示了几丁质酶通过类黏附素机制整合至毒素复合体的精细过程。构象分析表明YenTc可能代表一种新型成孔状态，其显著特征——包括CBD-B的向下构象和孔域的更充分弹出——可能直接源于几丁质酶结合带来的结构约束和功能需求。系统发育研究不仅重新定义了ABC毒素的分类框架，还表明几丁质酶整合是近期进化事件，可能为产生菌提供了适应性优势。这些发现为理解病原体毒性机制的分子进化提供了重要见解，也为针对不同ABC毒素亚型的特异性干预策略设计奠定了结构基础。