AAV介导的Ant1基因部分恢复线粒体功能可保护Ant1-/-联合mtDNA突变小鼠免于扩张型心肌病

《Nature Communications》：Partial restoration of mitochondrial dysfunction by AAV-Ant1 protects from dilated cardiomyopathy in Ant1-/- plus mtDNA mutant mice

本研究针对因SLC25A4 (ANT1)基因纯合缺失突变并伴有特定mtDNA单倍型（mtDNAU2）而罹患致命性儿科扩张型心肌病（DCM）的原发性线粒体病（PMD）患者，开展了AAV2/9-pDes-Gfp-mAnt1基因治疗研究。结果表明，新生儿心包注射AAV-Ant1，即使仅恢复10%的心脏ANT1蛋白表达，也能长期（12个月）显著改善Ant1-/-及Ant1-/-+ND6P25L小鼠的心肌病表型，逆转线粒体能量代谢及心脏收缩相关基因的异常表达。这为治疗线粒体心肌病提供了安全有效的基因治疗策略。

　　

在生命科学的广阔图景中，线粒体扮演着细胞“能量工厂”的关键角色。当这座工厂出现故障，便会引发一系列被称为原发性线粒体病（Primary Mitochondrial Disease, PMD）的遗传性代谢障碍。PMD是影响儿童和成人最常见的遗传代谢疾病之一，发病率约为1/5000。其中，心肌病是PMD患者一个尤为凶险的并发症，约20-40%的PMD患者会在出生至27岁间发展为心肌病。数据显示，伴有心肌病的PMD患儿十年死亡率高达67-71%，远高于不伴心肌病患儿的18-26%。因此，开发有效治疗线粒体心肌病的方法，对于挽救这些最脆弱患者的生命至关重要。

本研究聚焦于一种由核基因突变引起的特定PMD，其严重程度受线粒体DNA（mtDNA）背景的调控。患者携带腺嘌呤核苷酸转运蛋白1（Adenine nucleotide translocator-1, ANT1，由SLC25A4基因编码）的纯合缺失突变。令人惊讶的是，即使携带相同的ANT1突变，患者的临床表现也因继承的母系mtDNA单倍型不同而存在巨大差异：与常见的欧洲单倍型H（mtDNA^H)结合，患者表现为可存活至中年的肥厚型心肌病；而与较罕见的单倍型U2（mtDNA^U2)结合，则会引发致命的儿科扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM），患者常在幼年就需要心脏移植。

为了模拟这一临床现象并探索治疗方案，研究人员构建了相应的基因工程小鼠模型：一种是Ant1基因敲除（Ant1^-/-）小鼠，模拟肥厚型心肌病；另一种是将Ant1敲除与一个线粒体复合物I的错义突变MT-ND6 m.13997G>A (P25L, ND6^P25L)相结合，创造出Ant1^-/-+ND6^P25L小鼠，该模型能准确再现人类患者的严重扩张型心肌病表型，包括心脏收缩功能急剧下降（降低80%）和显著的心室扩张。

目前，尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的PMD相关心肌病根治方法，现有治疗多为姑息性。为此，研究团队致力于开发一种基因疗法。他们利用上述小鼠模型，评估了通过腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）递送正常Ant1基因的治疗策略。相关研究成果已发表在《Nature Communications》上。

关键技术方法概述

研究主要采用了以下关键技术：1. 构建了携带小鼠抗肌萎缩蛋白启动子（pDes）驱动绿色荧光蛋白（Gfp）和小鼠Ant1 cDNA的AAV2/9血清型病毒载体（AAV2/9-pDes-Gfp-mAnt1）。2. 对出生后3天的小鼠（包括野生型WT、Ant1^-/-和Ant1^-/-+ND6^P25L）进行心包内注射，并设立PBS和空载体（AAV2/9-pDes-Gfp）对照组。3. 长期（长达12-14个月）监测小鼠心脏功能，主要通过超声心动图进行评估。4. 利用蛋白质印迹（Western Blot）、数字PCR（dPCR）、免疫组织化学等技术验证病毒转导效率和ANT1蛋白表达。5. 通过批量RNA测序（RNA-seq）、质谱蛋白质组学和单核RNA测序（snRNA-seq）等多组学方法，在转录组和蛋白质组水平深入分析基因治疗对心脏细胞基因表达谱、信号通路及细胞类型特异性反应的影响。

AAV介导的线粒体Ant1基因转导

研究人员成功构建了AAV2/9-pDes-Gfp-mAnt1（简称AAV-Ant1）载体。新生儿期心包注射后，证实该载体能有效转导小鼠心脏，并在心脏、膈肌和肝脏中检测到Gfp mRNA表达。病毒基因组定量分析显示，心脏和肝脏中的病毒载量相似。免疫组化证实GFP蛋白在心肌细胞中分散表达。重要的是，在转导的Ant1^-/-和Ant1^-/-+ND6^P25L小鼠心脏线粒体中，检测到了ANT1蛋白的表达，但其水平仅为野生型小鼠的约10%。同时，心脏中固有的ANT2蛋白水平并未因Ant1缺失而上调补偿。进一步分析发现，约20%的心肌细胞为GFP阳性，表明转导虽限于部分细胞，但这些细胞能高水平表达转基因产物。这种表达可持续超过一年，且注射过程未引起显著的组织损伤、细胞死亡或炎症反应。

AAV-Ant1转导 ameliorate Ant1缺陷型心肌病

超声心动图分析显示，与野生型相比，未治疗的Ant1^-/-和Ant1^-/-+ND6^P25L小鼠在 stroke volume（每搏输出量）、ejection fraction（射血分数）、fractional shortening（短轴缩短率）、cardiac output（心输出量）等心功能指标上均出现显著恶化，并伴有左心室质量增加和室壁增厚。而AAV-Ant1治疗能显著改善这些异常参数，使心功能指标和左心室质量趋于正常。这种有益效应在雄性和雌性小鼠中均能观察到，并可维持长达12个月。特别值得注意的是，病情更严重的Ant1^-/-+ND6^P25L小鼠的心脏/体重比随年龄增长急剧上升，而AAV-Ant1治疗能有效遏制这一趋势。对照实验排除了注射操作和空载体本身的影响，证实疗效源于Ant1的表达。

AAV-Ant1转导改善Ant1缺陷的代谢效应

批量RNA测序证实，AAV-Ant1转导能使Ant1^-/-和Ant1^-/-+ND6^P25L小鼠心脏中Slc25a4 (Ant1) mRNA水平恢复至野生型的约10%。基因本体（GO）通路分析表明，Ant1缺失导致心脏肌肉分化、发育、收缩通路以及细胞外基质（ECM）基因表达异常，而AAV-Ant1部分逆转了这些变化。质谱蛋白质组学分析进一步揭示，Ant1缺失导致大量线粒体蛋白（尤其是复合物I亚基）下调，以及脂肪酸代谢、胶原VI等蛋白表达改变。AAV-Ant1治疗能显著缩小蛋白质浓度的变异范围，部分恢复多种线粒体和功能相关蛋白的水平，并逆转胶原VI蛋白的上调。这些结果说明，即使轻微提升线粒体能量代谢，也能对心脏功能产生巨大的有益影响。

AAV-Ant1转导减轻心室心肌细胞缺陷

单核RNA测序（snRNA-seq）在单细胞分辨率上揭示了AAV-Ant1治疗的作用机制。分析发现，Ant1缺失对心脏不同细胞类型的影响程度不同，其中心室心肌细胞（vCM）的基因表达变化最为显著，其次是成纤维细胞、内皮细胞等。在vCM中，Ant1缺失导致395个基因下调（主要与线粒体生物能量学和心肌功能相关，如Atp5b, Atp5o, Tpm1, Myl3）和33个基因上调（包括心肌病标志物Nppa, Nppb）。AAV-Ant1转导能显著上调Ant1^-/-vCM中92个基因的表达，这些基因几乎全部与线粒体生物能量学和心肌功能相关。尤为重要的是，治疗逆转了22个在Ant1缺失vCM中下调的关键基因，包括线粒体生物合成主调控因子Pgc1α (Ppargc1a)、复合物I结构亚基Ndufa6，以及肌肉功能基因Camk1d, Nexn, Adra1a等。在其他心脏细胞类型（如成纤维细胞、内皮细胞）中也观察到类似但程度较轻的基因表达逆转，提示可能存在由心肌细胞转导引发的细胞间通讯。

研究结论与意义

本研究证实，在模拟PMD心肌病的Ant1缺陷小鼠模型中，通过心包注射AAV介导的低水平Ant1 cDNA基因转导，是一种安全且有效的策略，能够显著缓解严重的心肌病。即使仅恢复10%的正常心脏ANT1蛋白表达（由约20%的心肌细胞产生约50%的正常蛋白），也足以对心脏功能产生远超比例的显著益处。这种“锐阈效应”在线粒体能量代谢疾病中常见，意味着仅需转导少量病变细胞即可实现临床转化性的治疗干预，同时最大限度地降低了潜在毒性风险。

AAV-Ant1治疗能够逆转Ant1缺陷心脏中线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和心脏功能相关基因的表达下调，即使在更严重的Ant1^-/-+ND6^P25L模型中也有效。虽然未能完全恢复复合物I活性，但治疗上调了关键复合物I基因（如Ndufa6, MT-ND5）和主调控因子Pgc-1α，表明微小的OXPHOS功能改变即可引发巨大的表型改善。

该研究首次展示了AAV介导的线粒体基因疗法治疗致命性PMD心肌病的可行性。鉴于研究团队此前已在骨骼肌中证实AAV-Ant1治疗的安全有效性，本研究为系统性治疗兼具肌病和心肌病的Ant1缺陷患者（包括携带ANT1突变和mtDNA^U2的儿童）铺平了道路，为挽救这些年轻生命带来了希望。