膈神经刺激通过ceRNA网络调控自噬和免疫细胞浸润预防呼吸机诱导膈肌功能障碍的机制研究

《Scientific Reports》：Identification of competing endogenous RNA networks involved in phrenic nerve stimulation preventing mechanical ventilation induced diaphragm dysfunction

本研究针对呼吸机诱导膈肌功能障碍(VIDD)这一临床难题，探讨了膈神经刺激(PNS)的保护机制。研究人员通过整合miRNA-Seq和RNA-Seq分析，首次构建了PNS响应的竞争性内源RNA(ceRNA)网络，发现miR-500-3p-RAB37和miR-133b-3p-L-selectin两条轴通过调控自噬和免疫应答参与PNS对VIDD的保护作用。该研究为RNA靶向治疗VIDD提供了新靶点。

　　

在重症监护病房，机械通气(MV)是挽救生命的重要支持手段，但长时间使用呼吸机却会带来一个棘手的并发症——呼吸机诱导膈肌功能障碍(VIDD)。这种情况表现为膈肌进行性萎缩和收缩功能下降，导致患者脱机困难、ICU住院时间延长，甚至增加死亡风险。尽管膈神经刺激(PNS)已被证明能够通过维持膈肌活动来减轻VIDD，但其背后的分子机制始终是个未解之谜。

近日发表在《Scientific Reports》上的一项研究，首次揭示了PNS通过竞争性内源RNA(ceRNA)网络调控自噬和免疫细胞浸润，从而预防VIDD的分子机制。这项研究由长治医学院和平医院重症医学科张明铭等研究人员完成，为理解VIDD的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要线索。

为了深入探索这一机制，研究团队建立了兔VIDD模型，将11只成年雄性新西兰白兔分为对照组(n=4)、机械通气组(n=3)和PNS组(n=4)。MV组和PNS组均接受24小时机械通气，而PNS组在此期间额外接受间歇性双侧经静脉膈神经刺激。研究结束后，收集膈肌组织进行miRNA测序(miRNA-Seq)和全转录组测序(RNA-Seq)分析。

关键技术方法包括：通过miRNA-Seq和RNA-Seq检测差异表达的miRNAs、circRNAs和mRNAs；使用生物信息学工具预测miRNA靶基因和circRNA-miRNA相互作用；通过双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的直接结合；利用RT-qPCR验证测序结果的可靠性；进行GO和KEGG通路富集分析揭示生物学功能和信号通路。

差异表达分析揭示关键调控分子

通过高通量测序，研究人员发现机械通气导致膈肌中miRNAs、circRNAs和mRNAs表达谱的显著改变，而PNS处理能够部分逆转这些变化。特别值得注意的是，miR-500-3p和miR-133b-3p在MV组中表达下调，而在PNS组中表达上调，表明它们可能是PNS保护作用的关键介质。

ceRNA网络构建识别核心调控轴

研究人员构建了一个完整的ceRNA调控网络，发现miR-500-3p直接靶向调控自噬相关基因RAB37，而miR-133b-3p则靶向调控参与免疫细胞浸润的L-selectin。双荧光素酶报告实验证实了这些直接的靶向关系。此外，生物信息学预测还识别出五个circRNAs(circRNA_12437、24673、14127、14942、12463)可能作为分子海绵吸附这些miRNAs，尽管这一相互作用尚未得到实验验证。

通路富集分析揭示生物学机制

KEGG通路分析显示，MV组中上调的基因主要富集于吞噬体活性、p53信号通路、NF-κB信号通路和趋化因子信号通路，表明机械通气激活了自噬和炎症反应。相反，PNS组中下调的基因富集于细胞黏附分子(CAMs)、趋化因子信号通路、NF-κB信号通路和吞噬体通路，提示PNS可能通过调节这些通路来抑制过度自噬和免疫细胞浸润。

实验验证关键分子相互作用

RT-qPCR结果验证了测序数据的可靠性，显示miR-500-3p与RAB37以及三个circRNAs的表达呈负相关，miR-133b-3p与L-selectin以及三个circRNAs的表达也呈负相关。双荧光素酶报告实验进一步证实了miR-500-3p与RAB37、miR-133b-3p与L-selectin之间的直接靶向关系。

讨论与结论

本研究首次描绘了PNS介导的ceRNA网络在VIDD中的调控作用，揭示了miR-500-3p-RAB37和miR-133b-3p-L-selectin两条轴在调控自噬过程和免疫功能中的关键作用。这些发现不仅深化了我们对VIDD发病机制的理解，也为开发针对性的RNA治疗方法提供了理论依据。

研究结果表明，机械通气通过下调miR-500-3p导致RAB37表达上调，进而促进自噬体形成，加剧膈肌萎缩；同时通过下调miR-133b-3p导致L-selectin表达上调，促进免疫细胞浸润和纤维化进程。而PNS则通过逆转这些变化，维持膈肌稳态，防止功能障碍的发生。

尽管该研究存在一些局限性，如未能验证circRNA-miRNA相互作用、样本量有限等，但它为后续研究奠定了重要基础。未来研究可进一步探索这些分子靶点的治疗潜力，优化PNS参数，并将这些发现转化为临床实践，最终改善接受机械通气治疗患者的预后。