Cas5二聚化与Cascade复合体组装的结构基础：I-C型CRISPR-Cas系统的结构洞察

《Scientific Reports》：Structural basis of dimerization and cascade formation by Cas5

本研究针对I-C型CRISPR-Cas系统中Cas5蛋白的结构与功能尚不明确的问题，开展了对Moraxella bovoculi来源Cas5（MboCas5）的结构生物学研究。研究人员通过X射线晶体学、SEC-MALS和定点突变等技术，首次揭示了MboCas5通过R72-D167盐桥稳定的独特二聚体结构，并证实该二聚化模式在不同物种Cas5中可能保守。研究还发现Cas5在独立存在时具有单体/二聚体两种活性形式，但在Cascade复合体中仅以单体形式参与组装。这些发现为理解I-C型CRISPR-Cas系统的组装机制提供了重要结构基础，对CRISPR系统工程化应用具有指导意义。

　　

在微生物与病毒永无休息的进化军备竞赛中，原核生物演化出了一套精巧的适应性免疫系统——CRISPR-Cas。这套系统如同细菌的“基因记忆库”，能够记录曾经入侵过的病毒或质粒的基因片段，并在再次遭遇时精准识别并切割这些外来遗传物质。其中，I型CRISPR-Cas系统因其分布最广且机制复杂而备受关注。I型系统通过一个多蛋白复合物——CRISPR相关抗病毒防御复合物（Cascade）来执行功能。值得注意的是，I-C亚型是I型系统中的“极简主义者”，它形成的Cascade复合物仅由Cas5、Cas7和Cas8三个核心蛋白构成，并且缺少在其他I型系统中负责crRNA加工的Cas6。这使得Cas5在I-C系统中扮演了更为核心的角色，它不仅要参与crRNA的加工，还在Cascade复合物的组装和稳定中起关键作用。

然而，尽管功能重要，Cas5蛋白的结构细节，特别是其寡聚化状态和参与复合物组装的分子机制，仍然存在争议。不同研究对Cas5在溶液中是单体还是二聚体莫衷一是，而这种 stoichiometry（化学计量学）的差异很可能直接影响其功能机制。为了解决这些根本问题，并深入理解I-C型Cascade的组装原理，发表在《Scientific Reports》上的这项研究，对来自Moraxella bovoculi的Cas5（MboCas5）展开了深入的结构与功能研究。

研究人员综合运用了多项关键技术来解析MboCas5的结构与功能。他们首先通过基因合成和分子克隆构建了MboCas5的表达载体，并在大肠杆菌中进行重组表达。利用镍柱亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）进行蛋白纯化，获得了高纯度的蛋白样品。通过 hanging drop vapor diffusion（悬滴蒸汽扩散法）进行蛋白质结晶，并在同步辐射光源下收集X射线衍射数据。采用分子置换法，并以AlphaFold3预测的结构作为搜索模型，解析了MboCas5的晶体结构。通过SEC与多角度激光光散射（SEC-MALS）联用技术精确测定蛋白在溶液中的分子量和寡聚化状态。利用定点突变技术构建关键界面残基的突变体，并结合SEC分析验证二聚体界面。使用PDBePISA服务器分析蛋白质-蛋白质相互作用界面，并通过AlphaFold3进行二聚体结构的预测和比对。此外，还利用DALI服务器进行结构同源性搜索，并通过体外转录和凝胶电泳分析进行了crRNA加工活性实验。

结构分析 of Cas5 from M. bovoculi

研究人员成功解析了MboCas5的晶体结构，分辨率达到3.33 ?。结构分析显示，每个不对称单元中含有四个MboCas5分子。MboCas5的整体结构由2个α螺旋和10个β折叠片层构成，呈现出典型的Cas5蛋白折叠模式。值得注意的是，在所有的四个分子中，第80-86位残基的区域均无法追踪到清晰的电子密度，表明该区域可能具有高度的柔性。B因子分析也证实，除了2-5连接环区域外，整个蛋白结构相对刚性。静电表面分析揭示了复杂的电荷分布模式，其中之前研究报道的Cas5活性位点区域在MboCas5中也形成了一个带正电的碱性斑块，提示其可能通过此表面结合RNA底物。

Dimeric structure of MboCas5

Cas5在溶液中的确切化学计量学一直存在争议。为了明确MboCas5的寡聚化状态，研究人员通过SEC-MALS分析测定其绝对分子量约为60.2 kDa，这与其理论分子量29.5 kDa的两倍非常接近，强有力地证明MboCas5在溶液中以二聚体形式存在。通过对晶体堆积的分析和PDBePISA服务器计算，研究人员发现由分子B和分子D（BD二聚体）形成的二聚体界面最可能具有生物学相关性。该界面埋藏了716.1 ?2的表面积，涉及20个氨基酸残基，并通过12个氢键和4个盐桥稳定，其中由R72和D167形成的盐桥是维持二聚体界面完整性的主要作用力。

为了验证这一二聚体界面，研究人员构建了旨在破坏界面相互作用的点突变体R72W（破坏盐桥）和Q38W（破坏氢键）。SEC分析显示，R72W突变体的洗脱体积明显后移，对应单体的分子大小，而Q38W突变体则仍保持二聚体形式。MALS分析进一步证实R72W突变体的分子量为34.4 kDa，确认为单体。这些突变体验证实验有力地支持了基于晶体结构分析所预测的二聚体界面。此外，利用AlphaFold3预测的MboCas5二聚体结构与实验解析的结构高度相似，进一步证实了该二聚体形式的真实性。

更有趣的是，当研究人员将本研究发现的MboCas5二聚体与先前报道的另一种Cas5（来自 Streptococcus mutans 的SmuCas5）二聚体结构进行比较时，发现两者在二聚化界面的取向上存在显著差异。利用AlphaFold3预测的SmuCas5二聚体结构更接近于本研究中的MboCas5二聚体，而非之前报道的结构，这表明本文所揭示的二聚化模式可能在Cas5蛋白中更为普遍和保守。

Structural comparison of MboCas5 with Cas5 homologs from other species

为了更全面地理解MboCas5的结构特征，研究人员将其与其他四种已报道的Cas5蛋白结构进行了比较。结构比对显示，尽管这些Cas5蛋白的整体折叠非常保守，但在对应于MboCas5中未结构化环的区域（第80-86位残基）存在显著差异。例如，在 Xanthomonas oryzae 的Cas5（XorCas5）中，该区域形成了两个长的螺旋，而在 Desulfovibrio vulgaris 的Cas5（DvuCas5）中则是一个延伸的环状结构。在另外两种Cas5中，该区域甚至无法被解析，提示其可能本质无序。这种结构可塑性暗示该区域可能在Cascade复合体组装过程中发生构象变化以适应与其他蛋白的相互作用。

序列比对显示，在SmuCas5中被鉴定为催化三联体（Y50, K120, H121）和RNA结合位点（K52, R134）的关键残基在MboCas5中是保守的，表明MboCas5很可能具有类似的crRNA加工活性。

Structural adjustment of Cas proteins in Cascade for secure complex formation

对已解析的I-C型Cascade复合物结构（含有DvuCas5）的分析发现，当Cas5整合到复合物中时，其柔性环区域（即“拇指模体”）会发生显著的构象重排，以便与Cas8和crRNA相互作用，从而稳定整个复合物。这种为适应复合物组装而发生的构象调整并非Cas5所独有。研究表明，Cas3在募集到Cascade复合物时也会发生显著的构象变化，以实现与Cas8更深入、更紧密的结合；Cas8自身同样会发生结构重排以容纳Cas3。这些发现共同支持了一个观点：Cascade复合物的形成涉及多个蛋白的构象协同变化，这是一种进化上的优化策略，以确保复合物能够稳定且功能精确地组装。

Comparison of crRNA processing activity between monomeric and dimeric forms of MboCas5

一个关键问题是：Cas5的二聚化对其功能是否必需？研究人员比较了野生型（二聚体）和R72W突变体（单体）MboCas5的crRNA加工活性。实验结果表明，两种形式的蛋白具有相似的crRNA切割能力，说明Cas5固有的crRNA加工活性并不依赖于其寡聚化状态。

那么，在完整的Cascade复合物中，Cas5是否可能以二聚体形式存在呢？通过将本研究解析的二聚体MboCas5中的一个单体与已报道的I-C型Cascade复合物中的Cas5结构进行叠合，研究人员发现二聚体中的另一个单体会与复合物中的Cas8蛋白发生明显的空间碰撞。这清楚地表明，在组装好的Cascade复合物中，Cas5是以单体形式整合的，其二聚体形式可能只是其在游离状态下的存在方式。

研究结论与意义

本研究成功解析了MboCas5的高分辨率晶体结构，并通过详尽的生化与突变分析证实了其通过R72-D167盐桥稳定的独特二聚体组装模式。研究不仅揭示了Cas5蛋白的结构可塑性，特别是其柔性环区域在Cascade组装过程中可能发生的构象重排，还明确了Cas5在游离状态下可具有单体/二聚体两种活性形式，但在功能性的Cascade复合体中仅以单体形式存在。

这些发现具有多重重要意义：首先，它澄清了关于Cas5寡聚化状态的争议，并提出了一个可能在不同物种Cas5中保守的二聚化界面。其次，对Cas5结构可塑性的洞察有助于理解最小化I-C型Cascade复合体如何通过组分蛋白的构象调整实现稳定组装。最后，该研究为未来基于结构的CRISPR-Cas系统工程提供了新靶点，例如通过干预Cas5的二聚化界面来调控Cascade复合体的组装或稳定性，从而开发新型基因组编辑工具。这项工作深化了对CRISPR-Cas系统，特别是I-C亚型组装机制的理解，为相关生物技术应用奠定了重要的分子基础。