异源组合VSV-GP与天然样三聚体在兔体内诱导自体Tier 2 HIV抗体

《npj Vaccines》：Heterologous combinations of VSV-GP and native-like trimers elicit autologous Tier 2 HIV antibodies in rabbits

本研究针对HIV疫苗研发中难以诱导广谱中和抗体的挑战，探讨了基于VSV-GP病毒载体表达膜锚定天然样Env三聚体（sC22v4/sC23v4 KIKO*）的免疫策略。通过异源初免-加强（载体/蛋白）方案，成功在兔模型中诱导出针对自体Tier 2假病毒的中和抗体，为HIV疫苗设计提供了新思路。

　　

人类免疫缺陷病毒（HIV）的疫苗研发是科学界面临的最严峻挑战之一。尽管抗逆转录病毒疗法能够有效控制病毒复制，但全球每年仍有超过130万新发感染病例，凸显了预防性疫苗的迫切需求。然而，HIV病毒的高突变率、其包膜蛋白（Env）的复杂结构以及免疫系统的逃逸机制，使得传统疫苗策略屡屡受挫。一个核心难题在于，自然感染中出现的广谱中和抗体（bnAbs）通常需要数年时间才能成熟，而疫苗需要在短时间内诱导出类似的保护性免疫反应。

在此背景下，模拟天然Env三聚体结构的抗原设计成为焦点。这些“天然样”三聚体被稳定在病毒入侵细胞前的预融合构象，能更有效地展示中和抗体表位，同时减少非中和抗体的产生。另一方面，疫苗递送平台也至关重要。病毒载体能够模拟自然感染，有效激发细胞免疫和体液免疫，但同源加强时常因抗载体免疫而效果受限。因此，将病毒载体与蛋白亚单位疫苗结合的异源初免-加强策略应运而生，旨在协同激发不同分支的免疫系统，规避抗载体免疫，并可能引导抗体反应向理想方向发展。

本研究由奥地利因斯布鲁克医科大学Janine Kimpel团队主导，联合德国、法国等多个欧洲研究机构，在《npj Vaccines》上发表了一项创新性研究。他们利用一种名为VSV-GP的嵌合病毒载体平台，该载体用水泡性口炎病毒（VSV）为骨架，但将其本身的G糖蛋白替换为淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的GP糖蛋白。这种改造不仅降低了VSV固有的神经毒性，还显著减弱了针对载体本身的中和抗体反应，使得多次接种成为可能。研究团队将重点放在了两款经过精心设计的Clade C亚型HIV-1 Env天然样三聚体抗原——sC22v4 KIKO* 和 sC23v4 KIKO* 上。这些抗原通过SOSIP（引入gp120与gp41间的二硫键和I559P突变）或NFL（用柔性 linker 取代弗林蛋白酶切割位点）方式进行稳定，并进行了糖基化修饰（Knock-in, KI 和 Knock-out, KO），以优化关键广谱中和抗体表位（如CD4结合位点，CD4bs）的可及性。

为了将这些优化抗原有效地呈递给免疫系统，研究人员构建了表达膜锚定形式Env三聚体的VSV-GP载体。他们将Env的胞外域（gp140）与VSV G蛋白的跨膜域和胞内尾融合，形成嵌合蛋白，确保抗原能高效地展示在感染细胞表面并掺入到新产生的病毒样颗粒上。此外，他们还引入了一项细微但重要的修改（Δ6修饰），即替换G蛋白的特定氨基酸序列，以增强膜近端外部区域（MPER）表位对10E8等抗体的可及性。

本研究主要运用了分子病毒学、免疫学和血清学领域的多种关键技术。核心方法包括：利用反向遗传学技术 rescue 并纯化重组VSV-GP-Env病毒；通过蛋白质印迹（Western Blot）和流式细胞术分析感染细胞中Env蛋白的表达、构象以及掺入病毒颗粒的情况；在动物模型（小鼠和兔）中进行免疫原性评估，包括不同的异源初免-加强方案（如V-V-P-P, V-P-V-P）；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中结合抗体滴度；通过TZM-bl细胞系基于的假病毒（Pseudovirus, PV）中和试验评估抗体功能，用于判定中和活性和层级（Tier 1/2）；以及利用流式细胞术进行抗原表位表征和T细胞免疫应答（如MHC I类四聚体染色）分析。

结果

1. VSV-GP载体表达的膜锚定天然样三聚体呈现良好构象并高效掺入病毒颗粒

研究人员首先在体外验证了VSV-GP载体表达Env抗原的能力。Western Blot结果显示，VSV-GP-sC22v4Δ6 KIKO* 和 VSV-GP-sC23v4Δ6 KIKO* 均能在感染细胞中高水平表达gp120，并且该嵌合Env蛋白能有效掺入到病毒颗粒中，水平与先前报道的VSV-GP-1086.C载体相当。病毒生长动力学实验表明，插入这些天然样三聚体抗原并未显著影响VSV-GP载体的复制能力。为了评估抗原构象，研究团队使用一组针对Env不同表位的中和抗体，通过流式细胞术分析了感染细胞表面的抗原展示情况。与开放的1086.C三聚体相比，sC22v4Δ6 KIKO* 和 sC23v4Δ6 KIKO* 三聚体几乎不被CD4诱导抗体17b识别，表明其保持了封闭的预融合构象。重要的是，Δ6修饰确实增强了MPER靶向抗体10E8的结合，证实了该设计的有效性。两种抗原与多种广谱中和抗体（如PGT145, VRC01等）的结合模式相似，但存在细微差异，例如sC23v4Δ6 KIKO* 对CD4bs抗体PGV04的结合更强，而sC22v4Δ6 KIKO* 则更易被V1/V2环抗体PG16识别。比较NFL和SOSIP配置的sC23v4Δ6 KIKO* 发现，两者在感染细胞表面的构象非常相似，因此后续研究选择了不依赖弗林蛋白酶切割的NFL配置，以增加体内应用的可靠性。

2. 携带天然样三聚体的VSV-GP载体在小鼠中具有免疫原性

在小鼠模型中，三次VSV-GP-Env载体免疫加一次同源蛋白加强的方案，能诱导强烈的Env特异性结合抗体反应。首次病毒免疫后三周即可检测到抗体，第二次病毒免疫后抗体滴度显著上升并达到平台期。长期随访显示，抗体滴度在末次免疫20周后仍维持在高水平。载体骨架（VSV核蛋白N）特异性的CD8⁺T细胞反应在VSV-GP-Env免疫组与对照载体组之间无显著差异，表明插入不同的Env抗原并未改变载体的整体免疫原性潜力。抗体亚类分析显示，反应以IgG1和IgG2a为主，IgG3水平较低。

3. 异源VSV-GP-Env/蛋白初免-加强方案在小鼠中诱导强效且持久的抗体反应

为了优化免疫策略，研究人员系统比较了多种初免-加强方案，包括同源载体（V-V-V-V）、同源蛋白（P-P-P-P）以及不同的异源组合（V-V-P-P, P-P-V-V, V-P-V-P, P-V-P-V）。结果显示，所有异源方案以及同源蛋白方案诱导的Env结合抗体滴度均显著高于同源载体方案，提示单纯依靠载体加强可能因抗载体免疫而效果受限。值得注意的是，即使在预先存在高水平Env特异性抗体的小鼠中，使用表面展示Env的VSV-GP载体进行加强免疫，依然能有效激发抗载体T细胞反应，表明该载体在已免疫个体中仍具应用潜力。抗体滴度在第二次免疫后基本达到峰值，且所有异源方案诱导的抗体在长期随访中均表现出良好的持久性。

4. 异源方案在兔模型中诱导Tier 1和自体Tier 2中和抗体

由于小鼠血清在HIV中和试验中易产生非特异性抑制，研究最终在兔模型中验证了两种异源方案：经典方案（两次载体初免+两次蛋白加强，V-V-P-P）和交替方案（载体-蛋白-载体-蛋白，V-P-V-P）。两种方案均诱导了相似的抗载体结合/中和抗体以及Env结合抗体。结合抗体滴度在免疫过程中稳步上升，并在末次免疫后长期维持在高水平。功能性的中和抗体分析是本研究的关键。假病毒中和试验表明，两种免疫方案均能诱导出针对Tier 1A病毒（MW965.26）的中和抗体。更重要的是，兔子血清能有效中和自体抗原对应的KIKO修饰版假病毒：sC22 KIKO（被归类为Tier 1）和sC23 KIKO（被归类为Tier 2）。然而，这种中和能力具有高度特异性。对于未经KIKO修饰的亲本病毒，sC22（Tier 1）仍能被较好地中和，但针对sC23（Tier 2）的中和活性则几乎检测不到。此外，未观察到对异源Clade B病毒SF162的交叉中和。

结论与讨论

本研究成功地对原有的VSV-GP HIV疫苗平台进行了双重优化。首先，采用异源初免-加强策略（VSV-GP载体 + 可溶性蛋白），有效克服了同源载体免疫的局限性，诱导出更强、更持久的抗体反应。其次，用新一代的天然样三聚体抗原替代了先前使用的开放性三聚体，显著提升了免疫原性的质量。

研究最重要的发现是，在兔模型中实现了对自体Tier 2假病毒的中和。尽管这种中和活性严格局限于与疫苗免疫原高度匹配的、经过工程化改造（KIKO）的病毒，而无法中和其亲本病毒，但这仍然是向正确方向迈出的关键一步。中和活性的差异提示，所诱导的抗体可能主要靶向了因糖基化敲除（KO）而暴露的CD4结合位点（CD4bs）相关表位。当这些保护性糖基在亲本病毒sC23上存在时，抗体就无法有效结合和中和。这也反映了sC23三聚体比sC23三聚体具有更封闭、更稳定的构象（sC23被归类为Tier 2，而sC23为Tier 1）。

该研究也存在一些局限性。例如，未能诱导出对亲本Tier 2病毒的中和抗体，表明抗体的广度仍需进一步拓展。未来可以探索先使用KIKO抗原引导抗体反应，再用非修饰抗原加强的策略，以“教育”免疫系统克服糖基屏障。此外，缺乏与其它成熟平台（如BG505三聚体）的直接比较。

总之，这项研究有力地证明了VSV-GP是展示HIV-1 Env天然样三聚体的一个高效平台，并且其与可溶性蛋白三聚体结合的异源免疫策略，是诱导功能性抗体反应的有效途径。这些发现为后续优化HIV疫苗设计，特别是旨在诱导靶向保守表位抗体的策略，提供了宝贵的实验依据和可行的技术平台。