新生儿骨髓间质液通过激活JAK-STAT3信号增强人间充质基质细胞成骨分化与归巢能力的研究

《Bone Research》：Neonatal bone marrow interstitial fluid supports expansion and osteogenic ability of human bone marrow mesenchymal stromal cells

本研究针对体外扩增人间充质基质细胞(hBMSCs)时出现的成骨潜能下降和归巢能力减弱等问题，开发了新生儿牛骨髓间质液(NBIF)培养体系。研究发现NBIF通过富集神经生长因子(NGF)、乳铁蛋白(LTF)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)等活性因子，显著提升hBMSCs的LEPR+祖细胞比例和CXCR4表达，并激活JAK-STAT3信号通路，最终增强其骨缺损修复能力。该成果为优化干细胞治疗策略提供了新型微环境模拟方案。

　　

在骨组织工程和再生医学领域，人间充质基质细胞(hBMSCs)因其多向分化潜能和免疫调节功能被视为理想的治疗工具。然而，这些细胞在体外扩增过程中会逐渐丧失干性特征——不仅增殖速度减缓，更关键的是成骨分化能力显著下降，同时归巢受体CXCR4表达急剧降低，导致移植后难以靶向至骨损伤部位。这一瓶颈严重制约了干细胞疗法的临床应用效果。

传统培养体系主要依赖胎牛血清(FBS)提供生长因子，但其成分与人体骨髓微环境存在显著差异。值得注意的是，新生儿骨髓富含造血干细胞和成骨倾向性基质细胞，而成年骨髓则以脂肪细胞为主。这种年龄相关的骨髓组成变化提示，新生儿骨髓间质液(NBIF)可能含有独特的活性因子，能够更好地维持hBMSCs的功能特性。为此，广州国家实验室和清华大学的研究团队在《Bone Research》发表论文，系统探究了NBIF对hBMSCs功能的调控作用及其机制。

研究人员首先建立了从新生牛(1-7日龄)和成年牛(36月龄)长骨中提取骨髓间质液的标准流程，获得蛋白浓度均为0.25 mg/mL的NBIF和ABIF(成人骨髓间质液)。通过细胞形态学观察、生长曲线绘制和流式细胞术鉴定，发现NBIF能支持hBMSCs长期扩增并维持CD73/CD90/CD105阳性率，但增殖速度低于FBS组。转录组分析显示NBIF培养的hBMSCs有1614个差异表达基因，其中890个基因上调，主要富集在组织发育和修复相关通路。

关键实验技术包括：骨髓间质液分离纯化、蛋白质组学质谱分析、RNA测序转录组分析、流式细胞术表型鉴定、Transwell细胞迁移实验、小鼠颅骨缺损模型评估等。所有动物实验均使用B-NDG免疫缺陷小鼠，hBMSCs样本来源于商业渠道(iCell)和医院伦理委员会批准的脐带采集。

NBIF增强hBMSCs成骨分化能力

通过茜素红染色发现，NBIF预培养的hBMSCs在成骨诱导后钙结节形成量显著高于FBS组，RUNX2和COL1A1基因表达上调2-3倍。相反，NBIF组细胞的成脂分化能力减弱，PPARG和FABP4表达下降，而软骨分化能力无显著变化。这表明NBIF特异性促进成骨谱系分化。

NBIF维持干细胞自我更新与归巢能力

转录组分析显示NBIF显著上调LEPR(瘦素受体)、PDGFR等成骨祖细胞标志物。CFU-F实验证实NBIF组碱性磷酸酶阳性集落数增加2.5倍。机制研究发现JAK-STAT3通路关键蛋白磷酸化STAT3(Tyr705)水平升高，使用抑制剂AG490或siRNA敲低STAT3均能逆转NBIF诱导的成骨基因表达。

尤为重要的是，NBIF培养使hBMSCs的CXCR4表达量提升3倍，Transwell实验显示其对CXCL12的趋化响应增强，且可被AMD3100(CXCR4拮抗剂)阻断。动物实验中，静脉注射NBIF预处理的GFP标记hBMSCs后，小鼠骨髓内GFP⁺细胞比例显著高于FBS组，免疫荧光证实这些细胞同时表达LEPR。

NBIF活性成分鉴定与功能验证

质谱分析发现NBIF富含2847种蛋白质，其中475种显著高于ABIF。关键差异蛋白包括抗氧化酶(CAT、SOD1等)和信号分子(NGF、LTF、HMGB1)。通过高效液相色谱分级筛选，确定分子量25-100 kD的组分(BM3)具有最强成骨诱导活性。进一步实验证实，由LTF、IGF1、NGF和HMGB1组成的"LINH鸡尾酒"可模拟NBIF效果，使hBMSCs的LEPR、RUNX2和CXCR4表达同步上调。

治疗潜力验证

在颅骨缺损模型中，NBIF预处理的hBMSCs移植组7周后骨缺损修复率达到34%，显著高于FBS组(20%)，微CT显示骨矿物质密度和骨体积分数均显著改善。

本研究首次系统揭示了新生儿骨髓间质液通过激活JAK-STAT3信号通路调控hBMSCs成骨分化与归巢能力的分子机制。不仅鉴定了HMGB1、LTF和NGF等关键活性因子，还开发出能模拟NBIF功能的LINH蛋白组合方案。这些发现为干细胞治疗提供了两种创新策略：直接使用NBIF作为培养添加剂，或采用LINH鸡尾酒方案优化现有培养体系。该研究深化了对骨髓微环境年龄依赖性变化的理解，为开发更高效的骨再生治疗方案奠定了理论基础。