综述：工程化CAR-T、CAR-NK和CAR-NKT细胞疗法以靶向癌症干细胞并克服干细胞样耐药

《Hormones & Cancer》：Engineering CAR T NK and NKT cell therapies to target cancer stem cells and overcome stem like resistance

本综述系统阐述了利用工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞、自然杀伤（NK）细胞及自然杀伤T（NKT）细胞靶向癌症干细胞（CSCs）这一前沿策略。文章深入剖析了CSCs的核心生物学特性及其介导治疗抵抗的机制，重点探讨了针对CSCs的特异性靶点（如CD133、EpCAM等）、克服免疫抑制肿瘤微环境（TME）的先进CAR工程策略（如装甲CAR、逻辑门控CAR），并创新性地提出了联合代谢调控（如诱导铁死亡ferroptosis）以协同增强疗效的新视角。同时，综述强调了多组学与人工智能（AI）在精准诊疗中的整合应用，为最终实现持久癌症缓解指明了方向。

　　

引言

癌症干细胞（CSCs），也被称为肿瘤起始细胞（TICs），是肿瘤内部一个独特的细胞亚群。它们具有自我更新和持续增殖的非凡能力，从而驱动肿瘤发生、维持肿瘤异质性，并分化为构成肿瘤主体的各种细胞。CSCs的一个关键且具有临床影响的特征是它们对常规抗癌疗法（包括化疗、放疗和分子靶向药物）具有内在和获得性耐药性。这种耐药性常常导致治疗后CSCs的选择性富集，进而驱动肿瘤复发并导致患者预后不良。因此，选择性靶向清除CSCs被认为是实现持久癌症缓解的关键策略。

当前基于CAR的免疫疗法格局：原理与临床现状

嵌合抗原受体（CARs）是一类革命性的合成重组受体，经过工程化改造，可将T淋巴细胞和其他免疫细胞的特异性和功能重新导向特定的肿瘤抗原。典型的CAR构建体采用模块化结构，包括几个关键组成部分：一个胞外抗原结合域（通常是源自抗体的单链可变片段scFv）、一个铰链或间隔区、一个跨膜结构域以及一个或多个胞内信号域。CAR设计的演变通常用“代际”来反映其胞内信号域的进步。

CAR-T细胞疗法在复发或难治性血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著成功。然而，尽管在血液瘤中取得了突破，CAR-T细胞疗法在实体瘤中却遇到了重大障碍。主要障碍包括高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME），它给细胞浸润带来物理障碍，导致营养匮乏，积累代谢废物，含有免疫抑制细胞群（如髓源性抑制细胞、M2巨噬细胞和调节性T细胞），并上调免疫检查点。这些因素共同损害了CAR细胞的持久性和效应功能，常常导致T细胞耗竭和有限的抗肿瘤活性。

鉴于CAR-T细胞的局限性，人们对开发CAR工程化的自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞作为有前景的替代效应平台产生了日益浓厚的兴趣。CAR-NK细胞具有优于CAR-T细胞的几个明显优势，包括更佳的安全性（细胞因子释放综合征CRS和神经毒性发生率极低）、在同种异体环境中移植物抗宿主病（GVHD）风险降低、以及独立于CAR激活的先天细胞毒性机制。CAR-NKT细胞是连接先天免疫和适应性免疫的独特淋巴细胞亚群，也是极具吸引力的CAR载体。它们拥有固有的抗肿瘤特性，表现出向肿瘤部位优先定位的趋势，具有MHC非依赖性的细胞毒性，并能激活TME内的其他免疫细胞。

用基于CAR-/CAR-NK-/CAR-NKT的疗法靶向癌症干细胞

用基于CAR的免疫疗法靶向CSCs的理论基础

CSCs对常规放化疗的固有耐药性，加上它们在肿瘤发生、进展、复发和转移中的关键作用，使得选择性清除它们成为实现持久癌症缓解的首要目标。基于CAR的细胞免疫疗法因其能够以MHC非依赖性方式识别肿瘤相关抗原（TAAs），为根除肿瘤细胞提供了一种高选择性且强效的方法。这一特性对于靶向CSCs尤其有利，因为CSCs经常采用MHC-I下调和抗原加工机制改变作为免疫逃逸策略，这使得它们对常规的T细胞反应不太“可见”。CAR的基本设计特征直接应对并绕过了这一关键的CSC免疫逃逸机制。

CSC特异性抗原的鉴定与选择用于CAR工程

成功靶向CSCs的关键在于鉴定那些在CSCs上高表达、但在健康组织上表达极少的表面标志物，从而确保治疗特异性并最大限度地减少在靶/脱瘤毒性。目前正在探索的CSC相关表面抗原越来越多地被作为CAR靶点，例如CD133（胶质母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症的干细胞标志物）、GD2（神经母细胞瘤）、EpCAM（上皮细胞粘附分子）、CD44、ALDH1A1（醛脱氢酶1家族成员A1）、B7-H3（CD276）、GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3）和LGR5（富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5）等。

已有很多临床前研究证明了CAR-T、CAR-NK和CAR-NKT细胞在靶向CSCs方面的功效，在各种体外和体内模型中能显著缩小肿瘤并提高生存率。这些有希望的结果推动了转化努力，导致针对几种以CSC为靶点的CAR-T疗法（包括针对EpCAM、CD44v6、CD133和GD2的疗法）的临床试验正在进行中。

靶向CSCs的CAR疗法面临的挑战与先进工程策略

克服免疫抑制性肿瘤微环境（TME）

实体瘤中的TME对免疫效应细胞极不友好，是CAR疗法有效性的主要障碍。为了对抗这些抑制机制，正在开发多种策略：

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  装甲CARs：这些是先进的CAR构建体，经过工程化改造，除了CAR本身外还能分泌各种蛋白质，如促炎细胞因子（如IL-12、IL-15、IL-7）或抗体样蛋白质。例如，经过修饰能分泌IL-12的CAR-T细胞可以增强抗肿瘤功效并招募内源性免疫细胞。
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  免疫检查点阻断：将CAR疗法与免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1抗体）联合使用可以减轻T细胞耗竭并增强抗肿瘤活性。或者，可以通过基因修饰（如CRISPR/Cas9介导的PD-1敲除）或表达嵌合PD-1/CD28受体（将抑制信号转化为共刺激信号）来改造CAR细胞，使其对检查点抑制产生抵抗。
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  TME重塑：直接修饰TME的策略包括使用淋巴细胞清除化疗（如环磷酰胺）以创造一个有利于CAR细胞浸润和功能的促炎环境。改造CAR细胞使其表达趋化因子受体（如针对IL-8的CXCR1、CXCR2）也可以改善它们向肿瘤部位的归巢和浸润。

减轻在靶/脱瘤毒性

对于基于CAR的疗法，一个重要的安全关切是在靶/脱瘤毒性风险，即CAR细胞识别并攻击低水平表达靶抗原的健康组织。

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  逻辑门控CARs：为了增强特异性和安全性，布尔逻辑门被纳入CAR设计，使CAR细胞能够区分健康组织和癌组织。例如，“与门”CAR需要同时识别两个在肿瘤细胞上表达、但不在正常细胞上单独表达的 distinct 抗原，才能触发完全激活。
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  亲和力调节：微调CAR对其靶抗原的亲和力可以创造一个治疗窗口，使得CAR细胞仅被肿瘤细胞上的高抗原密度激活，而不被健康组织上的低生理表达激活。
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  自杀基因和安全开关：在CAR构建体中加入可诱导的自杀基因（如诱导性半胱天冬酶-9）或共表达的表面标志物（如截短的EGFR），可以在发生严重毒性时快速清除CAR细胞。

应对抗原逃逸和肿瘤异质性

肿瘤异质性以及抗原逃逸是CAR治疗后复发的主要机制。

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  双靶向CARs：规避抗原逃逸的一个主要策略是改造CAR细胞，使其同时靶向两个不同的肿瘤相关抗原。这种方法要求肿瘤细胞同时丢失两种抗原的表达才能逃避治疗，这是一个概率低得多的事件。
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  具有更广泛免疫激活的“装甲”CARs：除了直接的双靶向，能够分泌免疫刺激细胞因子（如IL-12）的装甲CARs可以促进更广泛的内源性抗肿瘤免疫反应，包括表位扩展，从而降低抗原逃逸变体的风险。

增强CAR细胞的持久性和效力

基于CAR的疗法的长期疗效，尤其是在实体瘤中，关键取决于输注细胞的体内持久性和功能效力。

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  优化的CAR设计：共刺激结构域的选择仍然至关重要，例如4-1BB用于持续持久性，CD28用于快速激活，但最佳功能也受特定肿瘤适应症、疾病负荷和淋巴细胞清除方案的影响。
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  改进的制造和细胞来源：策略包括优化培养条件和采用基因操作（如CRISPR/Cas9）来增强CAR细胞的功能和持久性。使用同种异体“现货型”CAR-NK和CAR-NKT细胞，来源于脐带血或诱导多能干细胞（iPSCs），在可扩展性、一致性以及可能减少制造时间和成本方面具有优势。
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  联合疗法：将CAR细胞与常规药物或其他免疫疗法结合可以增强其持久性和抗肿瘤效果。

调控癌症干细胞代谢：一种协同治疗策略

癌症干细胞（CSCs）独特的代谢适应性既是一种生存机制，也是一个可利用的关键脆弱点。CSCs表现出与其分化的子代细胞不同的代谢特征，这些特征可能因肿瘤类型、患者甚至单个肿瘤内的亚克隆而异。这种代谢可塑性使CSCs能够适应不断变化的微环境条件，包括营养匮乏和缺氧，这有助于它们的恢复力和对常规疗法的耐药性。

CSCs的关键代谢脆弱点包括：

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  氧化磷酸化（OXPHOS）：耐药癌细胞和CSCs通常将其代谢重编程为增加OXPHOS活性，这为它们对抗常规疗法的生存提供了能量，并使它们能够适应波动的TME。使用抑制剂靶向OXPHOS可以选择性消除CSCs并延迟耐药性的获得。
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  脂质代谢：脂质代谢的改变对于维持CSCs的干性、支持癌症生长和导致耐药性至关重要。靶向这些途径中的关键酶，如脂肪酸合酶（FASN）、肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A），可以破坏CSCs的特性并使它们对治疗敏感。
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  谷氨酰胺代谢：癌细胞，包括CSCs，经常表现出“谷氨酰胺成瘾”，消耗大量谷氨酰胺以支持快速的生物合成、能量产生和氧化还原稳态。抑制谷氨酰胺代谢，例如通过靶向谷氨酰胺酶（GLS）或谷氨酰胺转运体如ASCT2，可以阻碍CSCs的自我更新并增加对治疗的敏感性。
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  糖酵解（瓦博格效应）：许多CSCs，特别是在缺氧的生态位中，严重依赖糖酵解进行快速的ATP生产。葡萄糖转运体（GLUTs）或糖酵解酶（如己糖激酶HK）的抑制剂可以破坏这种能量供应并诱导CSCs耗竭或分化。
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  铁死亡：这种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以脂质过氧化物的致死性积累为特征，代表了一个有前景的治疗途径。CSCs由于增殖对铁的高需求，经常表现出“铁成瘾”，使它们特别容易受到铁死亡诱导的影响。

协同策略：代谢调控与细胞免疫疗法相结合

CSCs固有的代谢灵活性表明，单靶点的代谢干预可能导致适应性耐药。因此，同时靶向多个代谢脆弱点或将代谢抑制剂与细胞免疫疗法相结合的联合策略正受到青睐。

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  代谢重编程以增强CAR疗效：操纵CSCs的代谢可能使它们对基于CAR的疗法更敏感。例如，在CSCs中诱导铁死亡可能通过改变TME或直接诱导应激，使它们更容易受到免疫细胞介导的杀伤。
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  用于靶向递送的纳米材料：纳米技术为靶向递送代谢抑制剂和铁死亡诱导剂到CSCs提供了有前景的解决方案，提高了它们的生物利用度和特异性，同时降低了全身毒性。
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  代谢途径的双重靶向：结合靶向不同代谢途径（例如，糖酵解和谷氨酰胺代谢，或铁代谢和脂质过氧化）的抑制剂可以产生协同效应，防止代谢逃逸并增强细胞死亡。
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  调控CSC静息状态：使静息CSCs“苏醒”进入分化状态，使其对疗法更敏感，或破坏其低代谢状态的策略，可以与基于CAR的方法相结合。

神经母细胞瘤的整合诊断与精准医学：CSC靶向治疗的范例

神经母细胞瘤（NB）是理解和应对癌症干细胞（CSCs）复杂性及治疗抵抗的一个引人注目的模型，尤其是在儿科肿瘤学中。其异质性的临床行为、高复发率和频繁转移，特别是在高危患者中，凸显了对先进诊断和精准医学方法的迫切需求。

整合多组学数据与先进人工智能（AI）和机器学习（ML）算法正在彻底改变神经母细胞瘤的诊断，为精准医学铺平道路。这种融合使得能够更全面地了解疾病的分子和临床特征，克服单一数据源的局限性。

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  液体活检：这种非侵入性方法分析体液（血液、尿液、脑脊液）中的循环生物标志物（如循环游离DNA（cfDNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）、细胞外囊泡（EVs））。液体活检可实时监测肿瘤演变、早期检测复发、识别可操作靶点以及评估微小残留病（MRD）。
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  影像组学：AI驱动的医学图像（CT、MRI、PET、MIBG）分析可以提高诊断精度，改善肿瘤检测、分割和表征，并预测分子特征如MYCN扩增状态。
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  单细胞和表观基因组分析：单细胞转录组学和表观基因组分析（如ATAC-seq、DNA甲基化分析）以前所未有的分辨率揭示肿瘤内异质性，识别不同的肿瘤细胞亚群，表征肿瘤微环境，并揭示肿瘤状态的关键分子标志物。
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  AI用于数据整合：AI和ML算法对于分析和整合这些高维、异质的多组学数据集至关重要。

结论

对靶向癌症干细胞（CSCs）以克服干细胞样耐药的先进CAR-/CAR-NK-/CAR-NKT细胞疗法的全面回顾揭示了一个充满活力且快速发展的领域，具有巨大的前景。CSCs作为肿瘤发生、进展、转移和治疗抵抗的“建筑师”，是肿瘤学中一个 formidable 的挑战。它们固有的可塑性和多样的抵抗机制，包括免疫逃逸和独特的代谢适应，需要高度靶向和适应性的治疗策略。

基于CAR的细胞免疫疗法在血液恶性肿瘤中展示了突破性的成功，为选择性根除肿瘤细胞提供了一个强大的平台。向CAR-NK和CAR-NKT细胞的战略转变对于实体瘤尤为显著，这是由其优越的安全性、“现货型”潜力以及多机制细胞毒性能力所驱动的，这可能规避了CAR-T细胞在复杂肿瘤微环境中观察到的一些局限性。

然而，有效靶向实体瘤中的CSCs仍然是一个重大障碍。诸如免疫抑制性TME、在靶/脱瘤毒性风险以及抗原表达的动态性导致逃逸变异等挑战，要求持续创新。先进的工程策略，包括装甲CARs、逻辑门控CARs和双靶向构建体，正在被开发以增强特异性、持久性并克服TME介导的抑制。此外，CSCs矛盾的代谢脆弱性，如它们的“铁成瘾”和对特定代谢途径的依赖，提供了可利用的“阿喀琉斯之踵”，用于协同治疗干预，特别是与靶向药物递送系统相结合时。

将多组学数据与人工智能和机器学习相整合，正在像神经母细胞瘤这样的疾病中彻底改变精准肿瘤学。这些先进的诊断工具能够实时、深入地了解肿瘤异质性和抵抗机制，超越传统方法，指导个性化的治疗决策。

最终，通过消除干细胞样抵抗来实现持久的癌症缓解，很可能需要一种多管齐下的方法。这包括持续开发具有增强特异性、持久性和TME调节能力的高度工程化的基于CAR的细胞免疫疗法；通过靶向小分子和新型药物递送系统战略性地利用CSC的代谢脆弱性；以及普遍整合AI驱动的多组学诊断，以实现真正个性化和适应性的治疗策略。这些领域的融合是克服最顽固的癌症形式并改善全球患者预后的关键。