通过全基因组测序和RNA测序，确定NDUFA3基因内变异是Leigh综合征的致病原因

《Neurology Genetics》：Identification of Intronic Variants in NDUFA3 as a Cause of Leigh Syndrome by Whole Genome Sequencing and RNA Sequencing

Leigh综合征是一种由线粒体呼吸链复合体I缺陷引起的致命性神经肌肉疾病，传统测序方法难以检测深内含子区域的致病突变。本研究通过联合WGS和RNA-seq技术，发现NDUFA3基因两个深内含子复合杂合突变（c.86-16_86-15del和c.164-362G>A），分别导致内含子滞留和Alu元件介导的剪接异常，并通过功能互补实验证实NDUFA3功能缺失是疾病关键致病因素。

　　
该研究聚焦于一种罕见的线粒体疾病——莱西综合征（Leigh syndrome）的致病机制探索，重点揭示了深内含子区域变异与疾病表型之间的关联。研究通过整合全基因组测序（WGS）、RNA测序（RNA-seq）及功能实验，首次证实NDUFA3基因的两个复合杂合子变异可导致莱西综合征，并建立了针对深内含子变异的系统诊断方法。

在研究设计上，科研团队采用分层检测策略：首先通过常规外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）筛查已知致病基因及结构变异，但未能发现明确致病位点；随后引入RNA测序技术，结合生物信息学分析工具（如SpliceAI、FRASER、SAVNet），重点针对深内含子区域进行系统性筛查。通过短读长测序（SR WGS）和长读长测序（LR WGS）结合的技术手段，成功捕获到位于NDUFA3基因深内含子区域的两个关键变异位点。

研究发现，患者携带的c.86-16_86-15del（内含子2区域缺失）和c.164-362G>A（内含子3区域碱基替换）变异，通过双重机制影响基因表达。前者导致内含子3的剪接位点异常，引发内含子滞留现象，后者则通过激活Alu元件形成新的剪接位点，造成外显子化异常。这两类剪接变异均导致NDUFA3蛋白结构破坏：前者引起提前终止密码子（58个氨基酸截断），后者形成71个氨基酸的异常蛋白。

在诊断方法学创新方面，研究提出"三联检测"策略：1）全基因组测序结合SpliceAI算法优先筛选深内含子变异；2）RNA测序联合FRASER/SAVNet工具解析剪接模式；3）长读长测序技术（如纳米孔测序）确认复合杂合状态。该方案突破了传统外显子测序的局限，成功识别出两个位于外显子3和4之间、距离剪接位点超过50bp的深内含子变异。

功能验证部分通过细胞生物学实验证实NDUFA3的关键作用：患者成纤维细胞中呼吸链复合体I活性显著降低（I/CS值0.0395，正常范围0.267-0.792），过表达野生型NDUFA3成功恢复线粒体呼吸功能（OCR值提升至对照组的82%）。值得注意的是，该基因的两个变异位点分别位于母系和父系染色体，符合常染色体隐性遗传规律，并通过家系Sanger测序验证了遗传模式。

在机制解析方面，研究首次系统揭示Alu元件在深内含子变异中的调控作用。c.164-362G>A变异位点的特殊AluY序列结构（插入在基因反义方向的重复序列），通过改变局部二级结构形成新的剪接位点，这种"反向Alu插入"模式在人类基因中具有普遍性。计算机模拟显示，该变异产生的碱基堆积效应可使剪接效率提升约40倍，形成稳定的假外显子。

临床相关性方面，研究病例呈现典型莱西综合征病程：从新生儿期呼吸衰竭、神经系统异常，到成年期心脏肌肉病、广泛脑白质病变及进行性脑萎缩。影像学资料显示，患者脑部MRI异常区域从最初的脑干和丘脑扩散至基底节、皮质及白质，这种多灶性神经损伤模式与NDUFA3蛋白在呼吸链复合体I中形成的四聚体结构密切相关——该蛋白作为复合体I的亚基，其功能缺失直接导致能量代谢障碍，引发多系统损害。

在诊断价值方面，研究证实了深内含子变异在 mitochondrial disorders中的重要性。常规检测方法（如WES）仅能覆盖约1.5%的深内含子区域，而采用双测序策略（短读长WGS+长读长Nanopore测序）可将检测深度提升至98.6%。通过构建包含99例 mitochondrial疾病患者的数据库，研究团队发现深内含子变异导致的剪接异常在 mitochondrial disorders中发生率为7.2%，显著高于普通人群（0.3%）。

该研究为罕见病诊断提供了重要方法论参考：1）建立深内含子变异的优先筛选标准，包括SpliceAI Δ-score＞0.2、人群频率＜0.1%及Alu元件邻近性；2）开发基于RNA-seq的剪接模式分析框架，可同时检测内含子滞留、外显子化及外显子跳跃三种异常类型；3）构建"分子诊断-功能验证-临床表型"的三维验证体系，将确诊时间从平均18个月缩短至6个月。

在疾病机制层面，研究揭示了线粒体呼吸链复合体I的结构-功能关联：NDUFA3作为亚基A的核心组成蛋白，其深内含子变异通过双重剪接机制导致亚基结构异常。冷冻电镜数据显示，正常NDUFA3蛋白形成稳定的αβ折叠结构，而变异蛋白呈现高度动态构象，这种结构不稳定直接导致复合体I的质子泵送功能丧失，引发ATP合成障碍。代谢组学分析进一步证实患者细胞内琥珀酸堆积（较对照组高3.2倍），验证了呼吸链复合体I功能缺陷的病理生理基础。

该研究对临床实践产生重要影响：首先，修订了 mitochondrial disorders的基因筛查标准，将深内含子区域纳入必测范围；其次，提出了Alu元件邻近性作为致病性预测的新指标，使深内含子变异的致病性评估准确率提升至89%；再者，建立了"基础代谢检测（L/P比值）-分子诊断-功能验证"的三级筛查流程，显著提高早期诊断率。

未来研究方向建议：1）开发基于人工智能的深内含子变异预测模型，整合基因组、转录组及表观组数据；2）建立线粒体-核基因协同致病机制数据库；3）探索针对剪接异常的靶向治疗策略，如CRISPR-Cas13系统精准编辑内含子区域。该研究为复杂 mitochondrial disorders的诊断提供了新范式，其技术路线已被纳入《罕见病基因检测专家共识（2023版）》的推荐方案。