编码钙调蛋白的基因对新皮质第4层神经元迁移和发育的独特贡献

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Distinct contributions of calmodulin-encoding genes to the migration and development of neocortical layer 4 neurons

钙调蛋白基因在皮质层4神经元迁移与身份决定中的特异性作用及其协同机制研究。Calm1基因敲低导致神经元迁移障碍和层定位异常，而Calm1与Calm2在神经元身份分化中具有协同功能。

　　

大手直人（Naoto Ohte）、古庄勇太（Yuta Furusho）、侯佩珊（Pei-Shan Hou）、杉田雄介（Yusuke Sugita）、野原蓝（Aoi Nohara）、吉泽祥子（Shoko Yoshizawa）、小林宏明（Hiroaki Kobayashi）、花岛卡丽娜（Carina Hanashima）

日本东京新宿区若松町2-2，早稻田大学教育与综合艺术科学学院生物系，邮编162-8480

摘要

钙信号传导在新皮质发育中起着关键作用，包括神经发生、神经元迁移、轴突路径寻找和突触形成。在这些过程中，神经元迁移对于将不同类型的神经元定位到六层皮质结构中至关重要。尽管其重要性不言而喻，但钙介导的信号传导在皮质神经元迁移过程中的精确时空协调机制仍不甚明了。在本研究中，我们探讨了编码相同蛋白质——钙调蛋白（calmodulin）的Calm1、Calm2和Calm3基因在新生皮质第4层神经元迁移中的作用。功能缺失分析表明，只有Calm1基因的缺失会干扰第4层神经元的迁移和正确定位，而Calm2和Calm3基因的缺失则不会。这一发现揭示了这些基因在调节新生皮质第4层神经元迁移和身份决定中的不同但互补的功能。

引言

在新皮质发育过程中，神经元迁移对于将神经元正确分配到最终位置至关重要，从而形成哺乳动物大脑特有的六层细胞结构。这一过程的紊乱可能导致神经元定位异常，并与脑裂畸形（lissencephaly）和精神分裂症等神经发育障碍相关[1]、[2]、[3]。构成新皮质各层的神经元起源于背侧端脑（dorsal telencephalon）的室管膜区（ventricular zone）的前体细胞[4]。细胞周期结束后，新生神经元从室管膜区和室管膜下区迁移到中间区。在迁移过程中，神经元会暂时呈现多极形态，随后转变为双极形态[5]、[6]。这种形态转变对于进入皮质板（cortical plate）至关重要，这一过程需要迁移中的神经元与皮质板内的神经元发生接触[7]。进入皮质板后，神经元沿胶质纤维向硬脑膜表面迁移并最终停止迁移。这一过程基于迁移后神经元的从内到外的分布模式来确定最终的层状排列[8]、[9]、[10]、[11]。

钙调蛋白是一种关键的Ca²⁺结合蛋白，具有EF-hand结构域[12]，作为主要的钙传感器并介导多种钙依赖性信号通路[13]、[14]、[15]。鉴于其在钙信号传导中的核心作用，钙调蛋白在真核生物中高度保守，其氨基酸序列在所有脊椎动物物种中均相同[16]。在哺乳动物中，有三个同源基因Calm1、Calm2和Calm3编码相同的钙调蛋白，尽管它们在人类编码序列中的核苷酸同源性仅为80-81%，在大鼠中为82-85%，在小鼠中为83-84%[17]、[18]。尽管钙调蛋白对神经元功能不可或缺，但其在大脑皮质发育中的具体作用以及这三个Calm基因的独特贡献仍不明确。鉴于其作为Ca²⁺传感器的核心作用，钙调蛋白可能成为调节皮质神经元迁移的潜在因子。相关研究已证实钙调蛋白参与了小脑前区神经元[19]和背根神经节神经元[20]的迁移。此外，最近的一项研究揭示了出生后早期第4层神经元中Calm1和Calm2的基因表达具有谱系特异性[21]，表明它们在这些神经元中的潜在发育作用。

在本研究中，我们通过shRNA介导的功能缺失实验（in utero electroporation）针对未来的第4层神经元，探讨了这三个Calm基因的作用。迁移动力学分析显示，Calm1基因的敲低显著抑制了神经元迁移，导致出生后神经元在皮质各层中的异常定位。进一步研究发现，Calm1或Calm2基因的敲低都会影响第4层神经元的身份形成，表明这两个基因对于正确的命运决定都是必需的。我们的发现首次揭示了钙调蛋白基因在新生皮质发育中对神经元迁移和身份决定的独特贡献。

实验方法

实验动物

实验动物饲养在早稻田大学动物设施（日本东京）和理研发育生物学中心动物饲养设施（日本神户）。所有动物实验均遵循机构动物护理和使用委员会批准的指导方针进行。为了对未来的第4层神经元群体进行单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq），我们将Neurog2 CreER/+小鼠[22]与Rosa26 CAG-loxp-Stop-loxp-tdTomato（Ai9）报告基因小鼠[23]进行杂交。这两系小鼠均

Calm1基因对未来第4层神经元的正常迁移至关重要

为研究钙调蛋白在皮质神经元迁移中的作用，我们首先检测了迁移过程中及迁移完成后这三个钙调蛋白基因在未来的第4层神经元中的表达模式。通过将Neurog2 CreER/+小鼠[22]与Rosa26 CAG-loxp-Stop-loxp-tdTomato（Ai9）报告基因小鼠[23]杂交，并在E15.25时给予4-OHT（标记未来第4层神经元的最佳时机[24]），我们分离出第4层神经元群体并进行了单细胞RNA测序

讨论

本研究探讨了钙调蛋白Calm1、Calm2和Calm3基因在未来的第4层神经元迁移和命运决定中的不同作用。我们发现Calm1基因是神经元迁移和迁移后定位的重要调节因子。此外，我们还证实Calm1和Calm2基因共同参与了第4层神经元身份的确定（见图6）。

Calm1基因敲低导致未来第4层神经元迁移缺陷

研究表明，只有Calm1基因的缺失会影响未来第4层神经元的迁移和定位，而Calm2和Calm3基因的缺失则不会。出乎意料的是，在Calm1基因敲低的小鼠脑中，双极细胞的比例增加，这表明多极到双极的形态转变并未受到严重影响。这一发现值得注意，因为迁移缺陷通常与这种转变的紊乱有关[7]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。相比之下，我们的结果

作者贡献声明

杉田雄介（Yusuke Sugita）：数据分析。侯佩珊（Pei-Shan Hou）：撰写、审稿与编辑、实验设计。野原蓝（Aoi Nohara）：数据分析。古庄勇太（Yuta Furusho）：实验设计、数据分析、撰写、原始稿撰写、可视化、验证、方法学研究、资金申请、数据分析。小林宏明（Hiroaki Kobayashi）：验证、资源提供、方法学研究。吉泽祥子（Shoko Yoshizawa）：实验设计。花岛卡丽娜（Carina Hanashima）：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、指导

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资金来源

本研究得到了日本科学技术机构（JST）的“SPRING”资助计划（项目编号JPMJSP2128，资助对象为N.O.）以及JSPS KAKENHI资助（项目编号16H06483、19H03237、25K09653，资助对象为C.H.）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Hanashima实验室的成员们提供的宝贵讨论。感谢D. Anderson博士提供Neurog2 CreER小鼠，感谢理研生物系统动力学研究中心（BDR）的C. Tanegashima、M. Kadota及该实验室提供的RNA-seq数据，以及K. Irie的技术支持。本研究还得到了日本科学技术机构“SPRING”资助计划（项目编号JPMJSP2128，资助对象为N.O.）和JSPS KAKENHI资助（项目编号16H06483）的支持