阴道毛滴虫单细胞水平病毒载量依赖性细胞异质性研究揭示毛滴虫病毒动态分布与宿主转录调控新机制

《iScience》：Viral load dependent cellular heterogeneity in Trichomonas vaginalis at the single cell level

本研究针对毛滴虫病毒在阴道毛滴虫群体内分布异质性及其功能意义这一关键科学问题，通过超深单细胞RNA测序技术，首次在单细胞分辨率揭示了TVV的镶嵌式分布模式及其动态波动特征。研究发现高病毒载量驱动与药物敏感性和粘附相关的转录改变，特别是MLF-like和组蛋白基因选择性上调。该研究为理解原生动物寄生虫中病毒介导的发病机制提供了新的理论基础。

　　

阴道毛滴虫是一种厌氧、有鞭毛的原生动物寄生虫，也是全球最常见的非病毒性性传播感染——滴虫病的致病源。虽然感染常常无症状，但女性感染可能导致阴道分泌物异常、外阴阴道炎症以及各种生殖系统并发症，包括增加HIV-1感染风险、宫颈肿瘤、不孕症和不良妊娠结局。甲硝唑作为一种硝基咪唑类化合物，仍然是滴虫病治疗的基石，通常治愈率达到84%-98%。然而，临床分离株中不断出现的药物疗效降低和耐药性报告，迫切需要阐明驱动寄生虫适应和药物反应性的分子机制。

阴道毛滴虫生物学的一个独特特征是其经常与毛滴虫病毒共感染。TVV是双链RNA病毒，属于假托蒂病毒科。尽管TVV是非溶细胞性的，但它可以通过双链RNA激活Toll样受体3来放大人类宿主的炎症反应。虽然TVV的宿主导向效应相对研究较多，但关于TVV感染对寄生虫本身的直接影响知之甚少。积累的证据表明，TVV可能通过改变基因表达和增强细胞致病性来调节寄生虫生物学。然而，研究TVV对这些寄生虫内在影响的转录组学研究产生了不一致且有时相互矛盾的结果。关键的是，先前没有研究在单细胞分辨率上解决病毒感染的群体内异质性问题，这在我们理解TVV如何塑造寄生虫生物学和表型多样性方面留下了显著的知识空白。

为了应对这些挑战，研究人员结合批量RNA测序和聚合酶链反应来系统确定分离株水平的TVV感染状态，然后利用单细胞RNA测序和免疫荧光 assay分析单细胞水平的病毒异质性和分布。他们专注于三个关键分离株：ATCC 50148（携带TVV1、TVV2和TVV3）、ATCC PRA-98（TVV2和TVV3，用于研究动态时间变化）和ATCC 30236（仅携带TVV1，用于在甲硝唑处理和不处理条件下进行差异基因表达分析）。这些方法首次提供了对阴道毛滴虫群体内病毒异质性的高分辨率表征，并直接解决了核心问题：TVV分布在单细胞水平是否是异质性的，以及病毒载量如何塑造寄生虫表型和转录程序？

研究首先通过将RNA测序数据映射到毛滴虫病毒的参考序列，系统分析了24个分离株的感染状态，确认了不同分离株的TVV感染谱系，包括无病毒感染的ATCC 50143、仅感染TVV1的ATCC 30236、双重感染的ATCC PRA-98（携带TVV2和TVV3）以及三重感染的ATCC 50148（携带TVV1、TVV2和TVV3）。RT-PCR验证结果与计算机RNA-seq分析结果一致，增强了测序方法在病毒鉴定中的可靠性。

为了研究毛滴虫病毒在阴道毛滴虫分离株内的分布，研究人员采用了单细胞RNA测序技术。测序数据使用Cell Ranger流程处理，随后使用Seurat v5.1.0和Monocle v1.3.7在R中进行下游分析。这些工具能够根据病毒转录本丰度对单个细胞进行分类。病毒分布的可视化显示，同一分离株内单个细胞之间病毒感染的 presence 存在显著异质性。这一观察结果通过免疫荧光实验得到进一步证实，该实验使用dsRNA特异性抗体显示了病毒双链RNA的特异性细胞质染色。这些发现共同证实，毛滴虫病毒在单细胞水平上表现出不均匀、镶嵌式的分布，即使在遗传上克隆的寄生虫群体中也是如此。

为了研究毛滴虫病毒感染的时间动态，研究人员比较了三个独立收集的单细胞数据集（代表不同的实验时间点Exp.1、Exp.2和Exp.3）中TVV亚型的分布。每个细胞根据感染状态分为四组：TVV2、TVV3、TVV2和TVV3共感染，或TVV阴性。值得注意的是，每个亚型的相对丰度随时间变化显着。Exp.1以TVV2和未感染细胞为主，而Exp.2显示TVV3感染细胞急剧增加。在Exp.3中，共感染（TVV2+TVV3）成为主要亚型，同时TVV3单独感染和TVV阴性群体减少。基于细胞计数的卡方检验证实这些组成差异具有统计学意义（****p < 0.0001），支持了TVV亚型分布在不同实验时间点非随机变化的假设。

在确定TVV负荷在分离株内存在时间和空间异质性后，研究人员接下来评估了这种异质性如何在药物压力下影响宿主基因表达。为了评估病毒异质性如何在单细胞分辨率下调节药物诱导的转录反应，研究人员首先优化了甲硝唑暴露条件，以诱导细胞应激而不引发大量细胞死亡。使用TVV1阳性分离株ATCC 30236进行了时间过程剂量反应分析，甲硝唑浓度范围为4至8μM。其中，6μM被确定为最佳亚致死浓度。该浓度在处理后6小时完全抑制寄生虫增殖，同时在6至9小时窗口内保持超过90%的细胞活力。选择这些参数是为了确保细胞在早期应激反应阶段保持转录活性，而不会进展到晚期细胞毒性。因此，6μM条件被用于下游的单细胞RNA测序实验。

为了研究毛滴虫病毒感染在单细胞分辨率下的分布，对来自同一阴道毛滴虫分离株（ATCC 30236）的两个样本进行了scRNA-seq，这两个样本是通过分裂单一培养物获得的。一个样本短暂暴露于亚致死浓度的甲硝唑（MTZ）1小时，而另一个样本保持未处理。对于下游分析，根据标准化的病毒转录本丰度将细胞分为三种感染状态：High_infection（病毒阳性细胞的前25%）、Infected（剩余的病毒阳性细胞）和Uninfected。病毒转录本水平在不同单个细胞之间差异很大，高水平感染的细胞表现出最高的病毒转录本丰度。感染状态的分布在两个样本之间也不同：样本30236主要由未感染细胞组成，而30236_M显示出更高比例的病毒阳性细胞。鉴于两个样本源自同一分离株并并行处理，观察到的差异可能反映了病毒分布的固有变异性。

由于单细胞数据稀疏性的固有局限性，研究人员采用了基于bootstrap的pseudobulk策略来提高差异表达分析的稳健性。在实现中，每个bootstrap执行五次重采样迭代，并系统改变bootstrap迭代次数（500 vs. 1000）和每个 replicate 采样的细胞数（150 vs. 200）。这些设置应用于两个生物样本（30236和30236_M），跨越感染 vs. 未感染和高感染 vs. 未感染比较。在不同配置下识别的DEG集表现出显著重叠。在感染 vs. 未感染的比较中，样本30236和30236_M中分别有82.5%（12,908个基因）和79.8%（8,151个基因）的DEG在所有采样方案中一致检测到。对于高感染 vs. 未感染条件，这些重叠进一步增加到85.6%（13,474个基因）和82.3%（8,440个基因），高感染组 consistently 产生比一般感染组略多的DEG。这些发现表明，病毒载量升高的细胞可能表现出更广泛的转录改变，并证实 pseudobulk bootstrap 框架在不同采样参数下产生高度一致的DEG结果。

为了阐明感染严重程度对宿主基因表达动态的影响，研究人员进行了分层分析，特别关注表现出高水平病毒载量的细胞。传统的差异表达分析通常将所有感染的细胞作为一个组与未感染的对应物进行比较；然而，当感染群体内存在显著异质性时，这种方法可能会掩盖与严重感染独特相关的转录反应。为了解决这个限制，研究人员基于病毒转录本丰度定义了一个“高感染”亚组，并进行了平行的差异表达分析，将这些细胞与未感染对照进行比较。

使用基于bootstrap的pseudobulk DE测试 across 两个实验组（30236和30236_M），研究人员计算了四种采样配置（500或1000个 replicates × 150或200个细胞 per group）下的绝对log2倍数变化（|log2FC|）值。在所有情况下，高感染组 consistently 表现出显著大于一般感染组的 |log2FC| 值（Wilcoxon检验，***p < 0.001），表明更高的感染负荷与更显著的转录重塑相关。

基于这些发现，研究人员接下来试图捕捉跨病毒载量全谱的细微、连续的转录变化。虽然bootstrap pseudobulk框架提供了稳健的组水平对比，但它无法解析单细胞数据固有的连续表达梯度。为了解决这个问题，研究人员实施了一种基于趋势的差异表达分析，将感染的细胞根据其病毒载量分为四分位数（Q1-Q4）。这种方法能够识别其表达水平随感染严重程度增加而单调变化的基因，从而更深入地了解宿主转录程序如何适应不同水平的细胞内病原体负荷。

在单细胞RNA测序分析中，研究人员鉴定了几种毒力和粘附相关基因，其表达与细胞内病毒载量呈正相关。虽然这些基因的功能作用，特别是在药物代谢、粘附和应激反应中，在阴道毛滴虫中已得到充分证实，但先前的研究关于病毒感染是否直接调节其表达的报告存在矛盾。使用基于趋势的单细胞方法，研究人员证实了与甲硝唑活化相关的基因，包括黄素氧还蛋白样折叠蛋白（TVAGG3_0053980, TVAGG3_0213430, TVAGG3_0585360, TVAGG3_0940660）、硫氧还蛋白样蛋白（TVAGG3_0038110, TVAGG3_0191900）、二硫键氧化还原酶（TVAGG3_0154220）和硝基还原酶家族蛋白（TVAGG3_0195320, TVAGG3_0427810, TVAGG3_0695620）。有趣的是，对于丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（PFO）（甲硝唑耐药的一个公认因素）没有观察到差异表达。两个注释的PFO前体基因（TVAGG3_0282970, TVAGG3_0890230）在对照样本的高病毒载量组中显著上调。

此外，泛素化相关基因（TVAGG3_0129220, TVAGG3_0221350, TVAGG3_0281680, TVAGG3_0586770, TVAGG3_0981600）在高病毒载量细胞中表现出表达增强，表明升高的病毒负荷可能放大细胞应激反应和蛋白质稳态途径。这一发现与观察到的甲硝唑敏感性相关基因表达升高（TVAGG3_0053980等）可能促进更快速或更显著的药物诱导细胞毒性反应一致。

对于粘附相关因子，研究人员观察到升高的病毒载量伴随着几个关键粘附基因的表达增加，包括TVAGG3_0540230、TVAGG3_0979910、TVAGG3_0163930和TVAGG3_0221780。值得注意的是，编码异多糖结合蛋白HPB2的TVAGG3_0232100的上调，最近被鉴定为一个重要的粘附因子。这些发现提供了高分辨率证据，支持病毒感染调节阴道毛滴虫关键毒力程序的观点。

除了先前表征的基因外，趋势分析还揭示了两个新的基因模块，其表达与病毒载量呈正相关：骨髓白血病因子相关基因（TVAGG3_0389720, TVAGG3_0515090, TVAGG3_0703230, TVAGG3_0912280, TVAGG3_0969640）和组蛋白编码基因（例如，TVAGG3_0221660, TVAGG3_0309740, TVAGG3_0408090, TVAGG3_0473430）。MLF样基因在贾第鞭毛虫中与应激反应和包囊样状态有关，而组蛋白的协调诱导表明高病毒载量可能引发染色质重塑。

这项研究首次在单细胞分辨率上描述了阴道毛滴虫中毛滴虫病毒感染的异质性。研究结果挑战了TVV感染是静态或均匀的假设，揭示了病毒分布和负荷在空间和时间上的显著变异性。病毒异质性对宿主转录有功能影响，高病毒载量细胞表现出与应激反应、药物代谢、粘附和表观遗传调控相关的基因上调。这些发现为理解TVV-宿主相互作用提供了新的框架，并强调了在原生动物寄生虫研究中考虑病毒异质性的重要性。

研究人员使用超深单细胞RNA测序来剖析TVV在阴道毛滴虫克隆群体内的分布。这种方法能够高灵敏度地检测病毒转录本，并直接量化单个细胞水平的感染状态。至关重要的是，研究人员实施了严格的质量控制过滤器，以排除由于细胞裂解或环境RNA污染导致的假阳性病毒信号，强调了严格验证以区分真实病毒感染与背景的必要性。

为了确定观察到的异质性是一个稳定特征还是反映了随时间的动态变化，研究人员检查了TV阳性分离株ATCC PRA-98的三个独立培养的生物学重复。这些重复的scRNA-seq分析揭示了病毒阳性细胞比例和主要TV亚型的显著时间变化。这些发现表明，毛滴虫病毒在阴道毛滴虫内的分布是固有动态的，可能由细胞间病毒交换、细胞分裂或内在调节机制塑造。

这种时间可塑性提出了一个重要问题：遗传均匀群体内病毒负荷的这种变异能否以有意义的方式影响宿主生物学？为了解决这个问题，研究人员对TVV阳性分离株ATCC 30236进行了超深scRNA-seq，从而可以在单细胞水平高分辨率量化病毒转录本。该分析揭示了感染细胞中病毒载量的梯度，为剖析TV对宿主基因表达的剂量依赖性效应提供了一个理想的系统。

病毒分布的固有异质性对于解释先前的转录组学和蛋白质组学研究具有重要影响，这些研究通常假设分离株内的感染状态是均匀的。未被识别的病毒载量或感染细胞比例的变异性可能导致了先前关于TVV对药物反应和基因调节影响的矛盾结论。通过使用单一分离株模型在受控培养条件下，本研究避免了分离株间的混杂因素，并能够直接探究群体内的病毒效应。

在这个完善的框架内，研究人员观察到TVV存在与甲硝唑敏感性增加和粘附相关基因的适度上调相关。相比之下，典型的毒力因子如半胱氨酸蛋白酶在转录水平上并未 consistently 被诱导。相反，他们的方法发现了两个先前未表征的响应病毒负荷的转录模块：骨髓白血病因子样基因家族和组蛋白相关基因。MLF同源物，先前在贾第鞭毛虫中与应激反应和包囊样状态有关，在高病毒载量细胞和甲硝唑处理条件下特异性上调，表明其在假包囊样适应中起作用。同样，核心组蛋白（H2A, H2B, H3, H4）在高病毒载量细胞中的协调诱导暗示染色质重塑可能是感染的下游后果，潜在地改变阴道毛滴虫的细胞周期进程、转录可塑性或应激适应。这些发现与在恶性疟原虫和弓形虫中观察到的组蛋白介导的调节机制相呼应，指出了跨原生动物寄生虫对细胞内感染的保守表观遗传反应。总之，这些发现拓宽了我们对阴道毛滴虫-病毒相互作用的理解，并突出了在病毒和药物相关应激条件下参与表观遗传调控的候选基因。

虽然TVV阳性和TVV阴性细胞在病毒转录本丰度和选定宿主基因（如HPB2、MLF样基因）的表达上表现出显著差异，但它们在无监督的UMAP或t-SNE投影中并未形成基于感染状态的离散簇。这可能反映了TVV驱动的转录重塑的连续和细微性质，其并不主导整体细胞方差。为了解决这个问题，研究人员实施了一个双管齐下的分析框架，以更灵敏地检测感染相关的转录变化。首先，一个基于bootstrap的pseudobulk策略聚合随机采样的单个细胞以减轻稀疏性并增强统计稳健性。其次，将病毒阳性细胞分层为基于病毒载量的分箱，并进行基于趋势的差异表达分析，以揭示跨感染梯度的逐渐、单调的基因表达变化。这种整合方法使他们能够解析条件特异性转变和病毒载量依赖性程序，否则这些将在全局聚类分析中被掩盖。为了检测这些细微的转录反应，研究人员采用了双管齐下的分析流程。首先，一个基于bootstrap的pseudobulk框架通过将随机采样的单个细胞聚合成稳定的表达谱来减轻稀疏性和技术变异性。其次，将病毒阳性细胞分层为基于病毒载量的分箱，并应用基于趋势的差异表达分析来识别跨感染梯度的逐渐、单调的变化。这种整合策略使他们能够以增强的可解释性和稳健性捕获条件特异性转变和负荷依赖性转录程序。

双链RNA病毒也在其他与人类疾病相关的原生动物寄生虫中被描述，包括利什曼原虫、贾第鞭毛虫、隐孢子虫和间日疟原虫，表明跨不同寄生虫物种的持久性病毒感染可能具有保守作用。基于我们的发现，这类内源性原生动物病毒可能代表先前被忽视的寄生虫生物学和毒力的调节剂——甚至可能在未来作为抗寄生虫策略中的治疗靶点或递送平台。

最后，研究结果对实验设计和治疗探索具有更广泛的意义。在克隆寄生虫群体中观察到的病毒存在和载量的异质性突显了在未来研究中需要考虑分离株内变异的必要性。同时，当前的一个主要限制是缺乏一个已建立的系统来实验性地清除阴道毛滴虫中的TVV并随后以受控方式重新引入病毒。为了解决这个差距，研究人员正在开发一个再感染平台，包括病毒清除的阴道毛滴虫系和细胞外囊泡介导的TVV递送。该系统将允许受控操纵病毒载量，与分离株特异性遗传背景解耦，从而促进严格的功能分析，以剖析TVV在宿主生物学、免疫调节和药物敏感性中的因果作用。

总之，本研究证明TVV在阴道毛滴虫中的分布既不是静态的也不是均匀的。通过超深单细胞转录组学和稳健的计算分析，研究人员揭示了先前未被充分认识的TVV-宿主相互作用的复杂性。这些数据不仅揭示了与应激适应和免疫逃避相关的新的宿主途径，而且为未来的机制研究建立了一个基础框架。最终，工作强调了将持久性病毒感染视为原生动物病理生物学的动态调节剂的重要性，对于理解疾病进展和识别新的治疗靶点具有潜在意义。

本研究主要应用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，结合批量RNA测序（RNA-seq）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行病毒感染的初始鉴定和验证。利用10x Genomics Chromium平台进行单细胞捕获和文库构建，并使用Illumina NovaSeq系列平台进行高通量测序。生物信息学分析采用Cell Ranger、Seurat和Monocle等标准流程进行数据预处理、细胞分类和可视化。差异表达分析采用基于bootstrap的pseudobulk策略和趋势分析，使用edgeR软件包进行，以增强结果的稳健性。此外，通过免疫荧光 assay使用dsRNA特异性抗体（9D5）在单细胞水平验证病毒dsRNA的分布。样本来源于美国模式培养物集存库（ATCC）的阴道毛滴虫临床分离株。

研究结果首先表征了不同阴道毛滴虫分离株中的毛滴虫病毒感染情况，通过RNA-seq数据映射和RT-PCR验证，确认了分离株的TVV感染谱系，为后续单细胞分析奠定了基础。单细胞RNA测序揭示了克隆寄生虫群体内毛滴虫病毒的镶嵌分布，通过scRNA-seq和免疫荧光 assay证实了病毒在单细胞水平的不均匀分布。毛滴虫病毒亚型比例在同一分离株内随时间波动，通过对ATCC PRA-98的三个独立时间点的scRNA-seq分析，发现TVV亚型组成随时间发生显著动态变化。亚致死甲硝唑处理使得能够在单细胞分辨率下解析早期应激反应，通过剂量反应分析确定了6μM甲硝唑作为保留细胞活力的亚致死条件，用于后续scRNA-seq实验。病毒载量在同一培养物的细胞间差异很大，对ATCC 30236及其甲硝唑处理样本的scRNA-seq分析揭示了单个细胞间病毒转录本水平的显著异质性，并将细胞分为未感染、感染和高感染三个状态。Bootstrap pseudobulk策略稳健地识别了跨采样参数的可重复差异表达基因，通过比较不同bootstrap配置下识别的DEG集，证明了该分析框架的高度一致性和可靠性。升高的病毒载量诱导广泛的转录重塑，通过比较感染组和高感染组与未感染组的|log2FC|，发现高病毒载量与更显著的转录改变相关。病毒载量与甲硝唑敏感性和粘附相关基因